Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
592495		A study on RNA and protein effectors of transcription factor activity and gene expression / Transkripsiyon faktörü aktivitesi ve gen ifadesinde RNA ve protein etkenleri üzerine bir çalışma Yazar:AYŞE DERYA CAVGA Danışman: PROF. DR. ZEHRA ÖZLEM KESKİN ÖZKAYA ; PROF. DR. ATTİLA GÜRSOY Yer Bilgisi: Koç Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya ve Biyoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı Konu:Biyofizik = Biophysics ; Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine Dizin:	Onaylandı Doktora İngilizce 2019 219 s.
Transkripsiyon faktörleri, hedef genlerin ifadesini arttırabilir veya baskılayabilir. Bu kritik rolleri sebebiyle transkripsiyon faktörlerinin aktivitesi sağlık ve hastalıkta belirleyicidir. Transkripsiyon faktörü aktivitesi, koaktivatörler, yükseltici (enhancer) RNA'lar ve protein oligomerizasyonu gibi birçok faktörün etkisi altındadır. Burada sunulan araştırmada, işlevsel genomik ve proteomik teknikleri bilgisayar analizleriyle birleştirerek, bu etkenlerin transkripsiyon faktörlerini ve gen ifadesini nasıl etkilediğini araştırdık, ayrıca bir transkripsiyonel baskılayıcının kanserdeki rolünü inceledik. Androjen reseptörünü (AR) bir model transkripsiyon faktörü olarak kullanarak, uzun kodlanmayan yükseltici RNA KLK3e'nin AR tarafından düzenlenen gen ifadesini nasıl etkilediğini karakterize ettik. İn vitro RNA çekimi (pulldown) ardından kütle spektrometresi uygulayarak, KLK3e ile etkileşen proteinleri belirledik. Etkileştiği tespit edilen proteinlerin DDX5, DDX17 ve HSPA8 gibi AR aktivitesini düzenlediği ve prostat kanserinde önemli roller oynadığı bilinen proteinler içermesi dikkat çekti. Sonuçlarımız ve RNA-protein kompleksinin bilgisayar modellemesi, KLK3e RNA'sının AR aktivitesinde olan etkisini, AR koaktivatörlerini transkripsiyon bölgesinde toplayan bir iskele görevi görerek gerçekleştirebileceğini gösterdi. Bu tür RNA iskele etkilerinin benzerleri, diğer nükleer reseptörler ve transkripsiyon faktörlerinde de yer alıyor olabilir. Örneğin östrojen reseptörü ve D vitamini reseptörü de RNA bağlayıcı protein DDX5 ile etkileşmektedir. Sonra, koaktivatör proteinlerin gen transkripsiyon profilini nasıl etkilediğini araştırdık. AR'nin farklı bölgelerine bağlanan ve protein etkileşimlerini bozan dört yeni küçük molekül inhibitör kullandık. Bozulan etkileşimleri saptamak için endojen proteinlerin hızlı immünopresipitasyon kütle spektrometre analizi (RIME) ve gen ifadesinin nasıl etkilendiğini anlamak için RNA sekans analizi uyguladık. Bir koaktivatör bağlanma bölgesinin, dimerizasyonun, DNA bağlanmasının ve ligand aktivasyonun inhibisyonunun benzer sayılarda protein etkileşimini olumsuz etkileyebildiğini gözlemledik. Ayrıca farklı noktaları etkileyen tüm inhibitörler gen ifadesi profilini de benzer şekilde etkiledi ve AR'nin transkripsiyonel aktivitesini düşürdü. Transkripsiyon faktörü oligomerizasyonunu incelemek için glukokortikoid reseptörü (GR) ile in siliko modellemeler yaptık. Deneysel gözlemler GR'nin mineralokortikoid reseptörü (MR) ile etkileştiğini, ve ayrıca DNA'ya bağlandığında homo tetramerler oluşturduğunu öne sürmüştü. Bilgisayar modellemelerimiz, deneysel gözlemlerdeki çeşitliliği açıklayarak GR ve MR'nin, nükleer reseptör ailesindeki yakın akrabaları tarafından paylaşılan çeşitli alternatif arayüzleri kullanarak etkileşime girebileceğini gösterdi. Modellerimiz, ligand veya antagonist bağlanmasının etkileşimi önlemediğini, fakat arayüz tercihini değiştirdiğini gösterdi. Bu şekilde farklı bölgeler farklı koaktivatörlerin bağlanması için açık kalıyor olabilir, ve bu durum farklı ligandların nasıl farklı hücresel sonuçlar doğurduğunu açıklayabilir. Ayrıca ligand bağlama birimi üzerinden GR tetramerizayonunu modelledik. DNA bağlama birimi üzerinden tetramerizasyonun kromozomal döngü modeliyle gerçekleşebileceğini gösterdik. Sirkadiyen saat düzenlemesi de transkripsiyonel faktörlere dayanır. Kriptokrom (CRY) bir sirkadiyen transkripsiyonel baskılayıcıdır ve silinmesinin kanseri geciktirdiği ve p53 mutant farelerin ömrünü uzattığı görülmüştür. p53 mutantlarda kriptokromun silinmesi üzerine UV hasarı tepkisindeki transkriptomik değişiklikleri RNA dizileme analizi ile araştırdık. Diferansiyel olarak ifade edilen genlerin Gen Kümesi Zenginleştirme Analizi (GSEA), IFN-γ immün sürveyansında ve NF-κB ile TNFα sinyalleşmesinde zenginleşme gösterdi. Protein ağı analizi, p21, Sirt1 ve Jun gibi yeni kilit oyuncular belirledi. Farklı düzeydeki genlerin yüksek oranda kodlamayan RNA içerdiği gözlendi. Kısaca, KLK3e arttırıcı RNA'nın AR ko-aktivatörleri ile etkileşime girdiğini ve ayrıca ko-aktivatör bağlanmasının, AR transkripsiyon aktivitesi üzerindeki etkisinin ligand aktivasyonu, DNA bağlanması ve dimerizasyonun engellenmesiyle benzer olduğunu gösterdik. Yapısal modellerimiz GR'nin alternatif arayüzlerle MR ile oligomerize olabileceğini ve ligand veya antagonist bağlanmanın arayüz tercihini etkileyebileceğini gösterdi. Ayrıca, p53 mutantlarında CRY silinmesinin UV hasarına apoptotik ve anti-tümörijenik tepkileri transkriptom düzeyinde nasıl arttırdığını gösterdik.
Transcription factors can activate or repress expression of their target genes. Given this critical role, their activity is decisive in health and disease. Transcription factor function is affected by numerous factors that include co-activators, enhancer RNA, and protein oligomerization. Combining functional genomic and proteomic techniques with computational methods, the research presented here investigated how these factors influence transcription factors and modify gene regulation, and the role of a transcriptional repressor in cancer. Using the androgen receptor (AR) as a model transcription factor, we characterized how the enhancer long non-coding RNA KLK3e affects expression of AR regulated genes. Combining in vitro RNA pulldown and mass spectrometry, we identified proteins that interact with KLK3e. These included known AR regulators such as DDX5, DDX17 and HSPA8 that were known to affect prostate cancer pathogenesis. Our results and computational modeling of the RNA-protein complex suggest that KLK3e RNA may influence AR mediated transcription through acting as a scaffold to gather AR co-activators near the transcription site. Such RNA scaffolding effects may be paralleled in other nuclear receptors and transcription factors, as DDX5 has been implicated to interact with other steroid receptors such as the estrogen and vitamin D receptors. Next we explored how co-activator proteins influence gene transcription. We used four novel small molecule inhibitors that target different sites on the AR and disrupt co-activator binding. To identify the disrupted interactions, we conducted rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) and incorporated RNA sequencing to understand the effects on gene expression. Inhibition of either a co-activator binding site, dimerization site, DNA binding site, or ligand binding site appeared to have a similar negative impact on the number of protein interactors. Also, all of the inhibitors that target different sites affected the gene expression profile similarly and reduced transcription by AR. To understand how transcription factor oligomerization occurs, we conducted in silico modeling with the glucocorticoid receptor (GR). Experimental observations suggested that GR interacts with the mineralocorticoid receptor (MR) and can also form homo-tetramers upon DNA binding. Our computational models explained the variation in experimental observations and demonstrated that GR and MR could interact through several alternative interfaces shared by close relatives of the nuclear receptor family. Predictions demonstrated that ligand or antagonist binding did not prevent interaction but rather changed the interface preference. This can leave different sites available for binding of co-activators, explaining why different ligands can produce different cellular outcomes. We also proposed a mechanism of action for GR tetramerization through the ligand binding domain, and the chromosomal looping model of interaction through the DNA binding domains. Finally, circadian clock regulation also relies on transcriptional factors. Cryptochrome is a circadian transcriptional repressor, and its deletion was observed to delay cancer and extend the lifespan of p53 mutant mice. With RNA sequencing analyses we investigated the transcriptomic changes following UV damage response upon cryptochrome deletion in a p53 mutant background. Gene Set Enrichment Analysis of differentially expressed genes demonstrated enrichment in IFN-γ immune surveillance and TNFα signaling via NF-κB. Protein network analysis pinpointed p21, Sirt1 and Jun as key players. Differentially expressed genes also contained a high ratio of non-coding RNAs. In short, we show that the KLK3e enhancer RNA interacts with AR co-activators, and separately we observed that inhibition of co-activator binding can have the same effect on AR transcription factor activity as inhibition of ligand activation, DNA binding, or dimerization. Our structural models showed how GR might oligomerize with MR through alternative interfaces, and that ligand or antagonist binding can affect interface preference. We also demonstrated how cryptochrome deletion in p53 mutants enhance apoptotic and anti-tumorigenic responses to UV damage at the transcriptome level.