Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
745306		Structural modifications and novel mini chaperone designs of an archaeal small heat shock protein, TPV sHSP14.3 / Bir arkea küçük ısı şoku proteinin (TPV sHSP14.3) yapısal modifikasyonlar ve özgün küçük şaperon tasarımları Yazar:SEMA ZABCI Danışman: PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics Dizin:Arkea = Archaea ; Gen klonlama = Gene cloning ; Isı şoku = Heat shock ; Mutagenez = Mutagenesis ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production ; Thermoplasma volcanium = Thermoplasma volcanium	Onaylandı Doktora İngilizce 2022 352 s.
Küçük ısı şoku proteinleri (sHSP) tipik bir yapısal öğe olan ve şaperon aktivitesinde ana işlevsel birim olarak kabul edilen korunmuş, alpha-kristalin bölgeleri (ACD) ile karakterize edilirler. Bu çalışmada, mutasyonların yapı ve fonksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak için Tpv sHSP 14.3'ün ACD'sinin hedef pozisyonlardaki gruplar, bölgeye özel mutajenez yoluyla farklı biyokimyasal özellikteki aminoasitlerle değiştirilmiştir. Şaperon aktivite deneylerinden elde edilen sonuçlar, Tpv sHSP 14.3 ACD mutantlarının ve yabanıl sHSP'nin, model substratlar, domuz kalbi sitrat sentazı (CS) ve maya alkol dehidrogenaz (ADH)'nin termal inaktivasyonunu önlediğini göstermiştir. Isı kaynaklı inaktivasyona karşı korumanın boyutunun, mutantlara göre değiştiği ve substrat proteinlere özgü olduğu bulunmuştur. Y34F mutasyonu ile ACD ve N-terminal bölgesinin kesişim yerinde hidrofobikliğin arttırılması, ADH ve CS'nin ısı kaynaklı inaktivasyonuna karşı sHSP proteinin koruma etkinliğini güçlendirmiştir. Ayrıca, ACD'nin yüklü gruplarının şaperon işlevindeki önemini incelemek için β3 ipliğinin 45. pozisyonundaki (E45G) negatif yük elimine edildiğinde, şaperon aktivitesi kötüye gitmiştir. Öte yandan, hidrofobik kalıntılar yerine yüklü grupların eklenmesi (yani, G48E, I108K, Y34FG48E, G48EI108K), ADH'nin ısı kaynaklı inaktivasyonuna karşı şaperon aktivitesinin artması ile sonuçlanmıştır. Bu sonuç, hem hidrofobik hem de elektrostatik etkileşimlerin, Tpv sHSP 14.3'ün şaperon aktivitesi için çok önemli olabileceğine işaret etmektedir. Çalışmamız aynı zamanda korunmuş iki motifin önemini de göstermiştir. Bu çalışma diğer sHSP'ler için daha önce yapılan bildirimlerle uyumlu olarak P/A-G ve G-x-L motiflerinin kritik rolleri hakkında ek kanıtlar ortaya koymuştur. Bu motiflerdeki tek nokta mutasyonları, A47D, G107A ve G107D, ortaya çıkan mutant proteinlerin stabilitesini ve aktivitesini değiştirmiştir. Rosetta Enerji düzeyindeki değişikliklere dayanarak, hidrofobik amino asitlerle yer değiştirmeye göre negatif yüklü kalıntılarla ikame durumunda fibrilasyon eğiliminde azalmanın daha fazla olduğu bulunmuştur. Mutasyonlar sonucunda, RR mesafesi yanı sıra, alfa karbon atomları arasındaki temaslar da değişmiştir. Değişim boyutu ikame edilen amino aside bağlı olup genellikle hidrofobik olanların uzun mesafeli temasları tercih ettiği görülmüştür. Diğer taraftan, uzun mesafeli temaslar ile mutant proteinin termodinamik stabilitesi arasında bir korelasyon olduğu bulunmuştur. Az artışın görüldüğü E43V mutant varyantı dışında, tüm mutant proteinlerin termodinamik stabilitesi azalmıştır. BN-PAGE analizi ile gösterildiği üzere, Tpv sHSP WT ve mutant varyantlarının büyük çoğunluğu, sHSPler için karakteristik olan 24-mer oligomere sahiptir. İstisna olarak, iki mutant (Y34F ve I108K) bunun yerine 36-merlik oligomerler oluşturmuştur. Özellikle, K87E mutant varyantında belirgin olarak oligomerik formların dengesi daha büyük türlerin oluşumu yönünde bir eğilim göstermiştir. Sonuçlarımız ayrıca, WT Tpv sHSP14.3'e kıyasla üstün şaperon aktivitelerine sahip oldukları dikkate alındığında, tasarladığımız özgün küçük şaperonların şaperon tedavisi için umut verici olabileceğini göstermiştir.
Small heat shock proteins (sHSPs) are characterized by a conserved, α-crystallin domain (ACD) which is the structural hallmark and considered as main functional unit in their chaperone activity. In this study, targeted residues in the ACD of Tpv sHSP 14.3 were replaced by amino acids of different biochemical features by site directed mutagenesis to analyze their effects on structure and function of the Tpv sHSP14.3. Results from chaperone activity assays showed that Tpv sHSP 14.3 ACD mutants and wild type prevented the thermal inactivation of the model substrates; pig heart citrate synthase (CS) and yeast alcohol dehydrogenase (ADH). The extent of the protection against the heat induced inactivation was found to be different among the mutants and specific to the substrate proteins. Increasing hydrophobicity at the junction of ACD and N-terminal domain by Y34F mutation enhanced protection efficiency of the sHSP against heat induced inactivation of the ADH and CS. To investigate the importance of the charge residues in the ACD for the chaperone function, when the negative charge at position 45 (E45G) of the β3 strand was eliminated, the chaperone activity was compromised. On the other hand, introduction of charged groups in place of hydrophobic residues (i.e., G48E, I108K, Y34FG48E, G48EI108K) resulted in higher chaperone activities against heat induced inactivation of ADH. This result indicated that both hydrophobic and electrostatic interactions can be crucial for the chaperone activity of Tpv sHSP 14.3. In accordance with the previous reports for other sHSPs, this study provided additional evidences for the critical roles of two conserved motifs; P/A-G doublet and G-x-L motif. Single point mutations, A47D, G107A and G107D, on those motifs, altered the stability and activity of the resultant mutant proteins. As deduced from changes in Rosetta Energy levels, substitution with the negatively charged residues more reduced than the hydrophobic amino acids the propensity of the sHSP variant for fibrillation. The contacts between alpha carbon atoms, as well as the RR distances, also varied as a result of the mutations. The extent of this variation was depended on the substituted amino acid, and the hydrophobic ones mostly preferred long-range contacts. On the other hand, there was a correlation between long range contacts and thermodynamic stability of the mutant proteins. Thermodynamic stabilities of the all mutant sHSP variants were reduced, except E43V mutant protein that had slight increase. The Tpv sHSP WT and most of the mutant variants possessed 24-mer oligomeric form which is typical for the sHSPs as revealed by BN-PAGE analysis. As an exception, two mutants (Y34F and I108K) instead formed 36-meric oligomers. The equilibrium of the oligomeric specie shifted toward larger species which was particularly obvious for the K87E mutant variant. Our results also indicated that the novel mini chaperones we designed regarding their superior chaperone activities as compared to WT Tpv sHSP14.3 can be considered promising for chaperone therapy.