Tez No İndirme Tez Künye Durumu
643494
Shedding new light on intracellular signaling pathways -establishing live-cell fluorescence imaging techniques using genetically encoded fluorescent biosensors / Genetik kodlanmış floresan biyosensörler yardımıyla floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak tek hücre analiz yaklaşımları
Yazar:HAMZA YUSUF ALTUN
Danışman: DR. EMRAH EROĞLU
Yer Bilgisi: Sabancı Üniversitesi / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Konu:Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin:
Onaylandı
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
79 s.
araçlardır. Bununla birlikte, bu güçlü araçlar genellikle karmaşık ve pahalı optik görüntüleme cihazları gerektirir. Genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin yeni nesilleri, tek bir dalga boyunda görüntülemeye izin veren tek FP tabanlı intensiyometrik problar olarak tasarlanmıştır. Bu çalışmada, yaygın olarak kullanılan tek FP tabanlı biyosensörlerin basit bir işik mikroskobunda kullanılıp kullanılamayacağını test ettik. Bu amaçla, yalnızca üç standart filtre seti ve üç renkli bir LED ışık kaynağı ile donatılmış geleneksel ve uygun fiyatlı bir epifloresan mikroskobu kullandık. Ca2+ görüntüleme için GECO'lar, NO görüntüleme için geNOps ve H2O2 görüntüleme için HyPer7 dahil olmak üzere üç farklı renkli biyosensörü test ettik. Sonuçlarımız, düşük çözünürlüklü ve basit bir mikroskobun bile uzamsal ve zamansal çözünürlük açısından sofistike bir görüntüleme cihazı ile aynı sonuçları verdiğini göstermektedir. Bu çalışmalardaki ikinci amaç da, D3-cpV gibi FRET tabanlı genetik olarak kodlanmış biyosensörleri kullanarak hücre içi Ca2+ sinyallerinin ölçümü için daha karmaşık FRET görüntüleme yaklaşımları oluşturduk. Ayrıca, FRET oluşumunun uzamsal çözünürlüğünü artırmak için Youvan algoritması olarak adlandırılan biyosensörlerle FRET analiz tekniklerini uyguladık ve oluşturduk. FRET çalışmalarına paralel olarak, in silico olarak sitozol ve mitokondriye farklı şekilde hedeflenmiş iki-moleküler bir yapıya dayanan yeni bir FRET tabanlı Asetil-CoA sensörü tasarladık ve ürettik. Genel olarak, bu çalışmalardaki stratejilerimiz: (i) basit bir geleneksel mikroskopta canlı hücre floresan görüntüleme oluşturulması (ii) genetik olarak kodlanmış FRET biyosensörleri kullanarak FRET yerelleştirme algoritmalarının uygulamasını (iii) ve FRET tabanlı genetik olarak kodlanmış Asetil-CoA sensörlerinin tasarlanıp geliştirilmesi
Genetically encoded biosensors are indispensable tools in cell biology and biotechnology. However, utilizing these powerful tools often require sophisticated and expensive optical imaging devices. New generations of genetically encoded biosensors are engineered as single FP based intensiometric probes that permit imaging on a single excitation and emission wavelength. In this study, we tested whether commonly used single FP based biosensors can be utilized on a simple widefield fluorescence microscope. For this purpose, we exploited a conventional and affordable epifluorescence microscope equipped with only three standard filter-sets and a three-color LED light source. We tested three differently colored biosensors including GECO's for Ca2+ imaging, geNOps for NO imaging, and HyPer7 for H2O2 imaging. Our results demonstrate that even a low-resolution and simple microscope yields the same results as a sophisticated imaging device in terms of spatial and temporal resolution. In the second aim in these studies, we established more complex FRET imaging approaches for quantification of intracellular Ca2+ signals using FRET-based genetically encoded biosensors such as D3-cpV. Besides, we applied and established FRET analysis techniques with biosensors - termed as Youvan's algorithm – to increase the spatial resolution of FRET occurrence. In parallel to the FRET studies, we in silico designed and generated a novel FRET-based Acetyl-CoA sensor based on a bi-molecular construct differentially targeted to the cytosol and mitochondria. Overall, in these studies, we demonstrate strategies and establish (i) live-cell fluorescence imaging on a simple conventional microscope (ii) the application of FRET localization algorithms using genetically encoded FRET biosensors (iii) and design and develop FRET-based genetically encoded Acetyl-CoA sensors.