Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
379578		A novel role for 5-hmC in the regulation of cancer testis gene expression in cancer and mesenchymal to epithelial transition / Kanserde ve mezenkimalden epitele geciş sürecinde 5-hmC'nin kanser testis gen ifadesindeki özgün rolü Yazar:SİNEM YILMAZ ÖZCAN Danışman: YRD. DOÇ. DR. ALİ OSMAY GÜRE Yer Bilgisi: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine Dizin:	Onaylandı Doktora İngilizce 2014 151 s.
Kanser testis (KT) genleri normal dokular içinde sınırlı şekilde sadece yumurtalık ve testislerdeki eşey üreme hücreleri ve trofoblast hücrelerinde ifade edilirken, pek çok kanserde sıklıkla ifade edildiği gözlenmiştir. Promotor bölgesine özgü DNA demetilasyonu ve histon deasetilasyonuyla ilgili açık bir ilişki haricinde bu genlerin ifade edilmesindeki spesifik mekanizmalar bilinmemektedir. Bu calışmada KT gen ifadesini daha iyi anlayabilmek icin KT genlerini bulunduran promoter bölgelerine özgü ve alana sınırlı epigenetik mekanizmaları test ettik. KT gen ifadesi varliginda ve yokluğundaki epigenetik mekanizmalari daha iyi calışabilmek için, KT genlerini dinamik olarak ifade eden bir model aradık. Öncü biyoinformatik analizler ve literatür araştırması sonucunda, KT genlerini Caco-2 farklılaşmasında incelemeyi seçtik. PAGE-2,-2B ve SPANX-B gen ifadelerinin farklılaşan Caco-2 hücrelerinde anlamlı şekilde arttığını gösterdik. Mezenkimal belirteç gen ifadeleri (Fibronectin1, Vimentin ve Transgelin) azaldığı ve eş zamanlı olarak epitel belirteç gen ifadeleri (E-cadherin, Claudin 4 ve Cdx2) arttığı için farklılaşma mezenkimalden epitele geçiş süreci olarak tanımlanmıştır. Bunun yanısıra, KT proteinlerini (SPANX-B ve PAGE-2,-2B) bulunduran hücrelerin epitel belirteç proteinini (CDX2) de bulundurduğu, mezenkimal belirteç proteinlerini (Fibronectin1 ve Vimentin) de bulundurmadığını gösterdik. Farklılaşmış Caco-2 hücrelerinde artan KT genlerinin promotor yakınındaki DNA bölgelerinde anlamlı demetillasyon gözlemlenmemekle birlikte bu bölgelerde hidroksimetilasyon seviyelerinde aşamalı bir artış tespit edilmiştir. Promotor yakını bölgelerdeki hidroksimetilasyon seviyesindeki artış aynı zamanda TET enzim seviyesindeki artış ile ve de TET2 proteini ve KT proteinlerinin aynı hücrelerdeki konumlanması ile uyumlu bulunmuştur. Bunların yanısıra, KT gen ifadesi ile birlikte KT genlerinin promotor bölgelerindeki EZH2 ve HP1 proteinlerinin işgali ve H3K27me3 işareti azalmıştır. Caco-2 farklılaşması tersine döndürüldüğünde KT ve TET gen ifadelerinin azalması ve epitelden mezenkimale geçiş ile sonuçlanmıştır. Böylece bu calışma ile ilk defa KT genlerinin dinamik ifadesi gösterilmiş, bu süreç mezenkimalden epitele geçiş ve DNA hidroksimetilasyonu ile açıklanmıştır. Promotor yakını bölgelerdeki değişimlerin yanısıra, kanserde KT gen ifadesine sebep olan epigenetik değişikliklerle alternatif epigenetik değişikliklerin aynı anda sınırları belli farklı bölgelerde meydana geldiğini düşündük. KT genleri ve KT genlerine komşuluk eden ama KT gen ifade paterninden farklı gen ifadesine sahip olan genler arasında sınırlar olabileceğini hipotezledik. Boylece, KT genlerine (PAGE-2,-2B ve SPANX-B) komşuluk eden ve kanserde gen ifadesi azalan 2 geni, ALAS2 ve CDR1'i, bulduk. ALAS2 ve CDR1 gen ifadelerinin sağlıklı dokulara kıyasla kolon ve akciğer kanseri hücre hatlarında azaldığını gösterdik. ALAS2 ve CDR1 gen ifadelerinin kanser hücre hatlarındaki azalışlarının KT gen ifadesinden farklı olarak DNA metilasyonundan bağımsız oldugunu bulduk. Kanserde ALAS2 ve CDR1 gen ifadesi azalışlarının promotor yakını bölgelerdeki artan hidroksimetilasyon seviyesi ile kuvvetli ihtimal ilişkili olabileceğini gözlemledik. PAGE-2,-2B ve SPANX-B gen ifadelerindeki artış da DNA hidroksimetillasyonu ile ilişkili bulunmustur, bu iki grup genlerinin farklı ifade paternlerine rağmen. Kanser hücre hatlarındaki ALAS2 ve CDR1 gen ifadelerinin çarpıcı azalışına rağmen, bu genlerin kanser hücrelerindeki ektopik ifadeleri sonucu hücre canlılığı ölçümlerinde anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır. ALAS2 ve CDR1, sırasıyla PAGE-2,-2B ve SPANX-B genlerine 200 ve 50 kbs uzaklıkta konumlandığından, bu bölgeler arasında farklı epigenetik olayların meydana gelmesinde etkili yalıtkan bir sınır bulunduğunu önermekteyiz. KT genlerinin neredeyse tamamı yüksek homolojik benzerliği bulunan tekrar bölgelerinde konumlandığından, bu tekrar bölgelerinin katlanarak 3 boyutlu yapılar oluşturması ve bu yapıların eş güdümlü KT gen ifadesinden sorumlu mekanizma olması muhtemeldir. Bu hipotezi test etmek icin, NY-ESO-1 genini içeren tekrar bölgesinin içindeki ve dışındaki genlerin ifadesini inceledik. Ancak anlamlı bir ilişki tespit edemedik. Anahtar sözcükler: Kanser testis genleri, PAGE-2,-2B, SPANX-B, DNA hidroksimetilasyonu, mezenkimalden epitele geçiş
Cancer/testis (CT) genes show highly restricted expression among normal tissues, limited to germ cells in the testis and ovary, and to trophoblast cells, , but are frequently expressed in various cancers. Other than a clear association with promoter-specific demethylation and histone deacetylation, the specific mechanisms by which these genes are expressed are currently unknown. In this study, we tested various mechanisms including promoter- and region-specific epigenetic mechanisms to gain a better understanding of CT gene expression. To better study the epigenetic mechanisms regulating CT gene expression, we searched for a model that dynamically expresses CT genes. As a result of preliminary bioinformatic efforts and literature search, we chose to study CT gene expression in Caco-2 spontaneous differentiation model. We showed that PAGE-2,-2B and SPANX-B genes were up-regulated significantly as Caco-2 cells differentiated. Differentiation was also characterized as a mesenchymal to epithelial transition as evidenced by the decrease in mesenchymal markers (Fibronectin1, Vimentin and Transgelin) and the concomitant increase in epithelial markers (E-cadherin, Claudin 4 and Cdx2). CT protein (SPANX-B and PAGE-2,-2B) positive cells were positive for epithelial protein (Cdx2), and negative for mesenchymal proteins (Fibronectin1, Vimentin). Although we could not find a significant difference in promoter proximal DNA demethylation of CT genes, we identified that promoter proximal DNA was hydroxymethylated with a gradual increase in hydroxymethylation as cells differentiated. The change in hydroxymethylation level was concordant with an increase in TET enzyme levels and co-localization of TET2 protein with CT proteins in the corresponding cells. Besides, we found that promoters of CT genes lost EZH2, H3K27me3 and HP1 marks as CT genes were up-regulated. Reversal of differentiation resulted in loss of CT and TET gene expression and EMT induction. Thus, for the first time, we describe dynamic expression of CT genes in association with DNA hydroxymethylation in mesenchymal to epithelial transition. In addition to promoter-proximal alterations, we thought that epigenetic alterations leading to CT gene expression in cancer could occur within larger regions containing CT genes, but with clear boundaries. As genes that do not show an expression pattern similar to CT genes can be located within their proximity, we hypothesized that there could be clear boundaries between neighbouring regions containing CT genes and those with non-CT type expression patterns. We, therefore, identified 2 genes; ALAS2 and CDR1, in close proximity to two different CT genes (PAGE-2,-2B and SPANX-B), which were downregulated in cancer, and thus showed an expression pattern opposite to that of these two CT genes. ALAS2 and CDR1 were downregulated in lung and colon cancer cell lines compared to healthy counterparts. We found that the downregulation of ALAS2 and CDR1 in cancer cell lines, in contrast to CT genes, was independendent of DNA hypomethylation. We also found that ALAS2 and CDR1 downregulation in cancer was possibly related to decreased levels of hydroxymethylation in promoter proximal regions. As the upregulation of PAGE-2,-2B and SPANX-B genes was associated with increased hydroxymethylation at promoter-proximal regions, these two groups of genes, despite their close proximity were found to be controlled inversely albeit possibly by the same mechanisms. We tested if ectopic upregulation of ALAS2 and CDR1 in cancer cell lines would result in a tumor-suppressive effect, but were unable to find any. As both genes are located about 200 and 50 kbs from SPANX-B and PAGE-2, we propose that the there might be a boundary within these regions that could possibly have an insulator-like function to help distinguish the two very different epigenetic events occuring in tumorigenesis. As almost all CT genes map within highly homologous inverted repeats it is possible that 3 dimensional chromosomal structures formed around these repeats underlie the common epigenetic mechanism responsible for coordinate CT gene expression. To test for this hypothesis, we analyzed expression of various transcripts identified within and outside the NY-ESO-1 repeat region. However, we could not find a correlation between the presence of such transcripts and CT gene expression patterns. Keywords: Cancer testis genes, PAGE-2,-2B, SPANX-B, DNA hydroxymethylation, mesenchymal to epithelial transition