Tez No İndirme Tez Künye Durumu
177623
Fasulye bitkisinde (Phaseolus vulgaris L.) partikül bombardımanı (biyolistik) yöntemiyle gen aktarımının optimizasyonu / Optimization of regeneration and transformation conditions for common bean (Phaseolus vulgaris)
Yazar:MUSTAFA ÇEVRİM
Danışman: Y.DOÇ.DR. MİKAİL AKBULUT
Yer Bilgisi: Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Konu:Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: 		Onaylandı
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
86 s.
Bu çalışmanın temel amacı, OBİTEK ve ODTÜ ortaklığıyla üretilen YELEPE 03 Partikül Bombardıman sistemi kullanılarak fasulyede (Phaseolus vulgaris) partikül bombardımanı metoduyla transformasyon ve rejenerasyon şartlarının optimize edilmesidir. Rejenerasyon şartlarının optimizasyonu bitkilerde genetik transformasyonun başarısı için gereklidir. Bununla birlikte baklagillerin rejenerasyonu hala zordur ve özellikle dane baklagillerin inatçı olduğu düşünülmektedir. Rejenerasyona en yi cevap veren genotipi tespit etmek amacıyla doku kültürü çalışmalarında, 9 farklı Türk fasulye kültüvarı (Eskişehir-855, Şahin-90, Yunus 90, Önceler, Aras, Akdağ, Göynük 98, Zülbiye ve Akman-98) kullanılmıştır. Doku kültürü çalışmalarında Standart MS-Gamborg ortamı kullanılmıştır. Kazein, glutamin ve STSAgNO3' ün doku kültürü ortamına eklenmesi rejenerasyon şartlarını önemli derecede iyileştirmiştir. Çeşitli sitokininlerin farklı konsantrasyonları (benzylaminopurine, thidiazuron, kinetin ve zeatin ribozid) ve onların çeşitli kombinasyonları embriyonik uçlardan çoklu sürgün uyarımı için kullanılmıştır. Test edilen sitokininler arasında 5 mg/L BAP , 0,5 mg/L TDZ, 1 mg/L Kinetin, 0,5 mg/L zeatin ribosid kombinasyonu çoklu sürgün uyarımı için (eksplant başına 12 sürgün) en iyi bulunmuştur. Direk transformasyon metotları inatçı bitkilerin Agrobacterium yoluyla transformasyonuna nazaran daha avantajlıdır. Partikül bombardımanı fasulyede şimdiye kadar uygulanmış gen aktarım metotları arasında yegane başarı sağlamış yöntemdir. Türkiye'de yaygın tarımı yapılan fasulye kültüvarlarında transformasyon etkinliğini optimize etmek amacıyla üç farklı basınçla atış (30,35,40 bar), üç farklı negatif çember basıncı (-720,760,800 mmHg), iki farklı mikroprojektil uçuş mesafesi (9 ve 12 cm), iki farklı transfeksiyon ve DNA sarıcı ajan (spermidine ve lipofektamin), iki farklı mikroprojektil (altın, tungsten) ve iki farklı DNA konsantrasyonu (1 ve 2 mg/ml) denenmiştir. Akman kültüvarı rejenerasyona en iyi cevabı verdiğinden dolayı transformasyon çalışmaları boyunca kullanılmıştır. Transformasyonun etkinliği geçici GUS aktivitesine bakılarak belirlenmiştir. GUS ifadesinin odakları her muamele için 10 embriyoda sayılmıştır. Denemeler arasındaki önemlilik farklarını belirlemek için ANOVA uygulanmıştır. Transformasyon etkinliği aşağıdaki parametreler uygulandığında en iyi bulunmuştur: 1. 35 bar atış basıncı 2. -760 mmHg kabin basıncı 3. 9 cm atış mesafesi 4. 2 ?g/ ?l DNA konsantrasyonu 5. Mikroprojektil olarak tungsten 6. DNA çöktürücü ajan olarak spermidin 7. Petri başına 6 atış Anahtar Kelimeler: Fasulye, Partikül Bombardımanı, Doku kültürü, Gen Aktarımı, GUS .
Main purpose of this study was to optimize regeneration and particle bombardment based transformation conditions for common bean (Phaseouls vulgaris L.) by using YELEPE 03 particle bombardment system produced by OBİTEK and ODTÜ consortium. Optimization of regeneration conditions is important for successful transformation of plants. Regeneration of grain legumes is still difficult and especially grain legumes are considered to be recalcitrant. In tissue culture studies, nine different Turkish common bean cultivars (Eskişehir-855, Şahin-90, Yunus-90, Önceler, Aras, Akdağ, Göynük-98, Zülbiye ve Akman-98) were used to determine the best responding genotypes. Standart MS-Gamborg medium was used throughout the tissue culture study. Use of casein, glutamine and STS-AgNO3 dramatically improved the regeneration conditions. Different concentrations of various cytokinins and their combinations (benzylaminopurine, thidiazuron kinetin and zeatin riboside) were used for multiple shoot induction from embryo axes. Among the tested cytokinins, 5 mg/L BAP, 0,5 mg/L TDZ, 1 mg/L Kinetin, 0.5 mg/L zeatin riboside combination was found to be optimum (12 shoot per embryo axes) for multiple shoot induction. Direct transformation methods have advantage over Agrobacterium mediated transformation of recalcitrant plants. Particle bombardment is the only successful method which has been applied to genetic transformation of common bean so far. To improve transformation efficiency in Turkish common bean cultivars, three different shooting pressure (30, 35, 40 bar), three different negative chamber pressure (-720,-760, -800 mmHg), two different microprojectile flying distance (9, 12 cm), two different transfection and DNA precipitating agent (spermidine and lipofectamine), two different microprojectile (gold and tungsten) and two different DNA concentrations (1 and 2 mg/l) have been utilized to optimize the transformation efficiency. Since Akman cultivar was the best responding genotypes for regeneration, it was used throughout the transformation studies. Transformation efficiency was determined according to number of transient GUS expressing foci. ANOVA was carried out to determine the significance of difference among the means of treatments. Transformation efficiency was best when the following parameters were used: 1. 35 bar shooting pressure 2. -760 mmHg chamber pressure 3. 9 cm shooting distance 4. 2 ?g/ ?l DNA concentration 5. Tungsten as a microprojectile 6. Spermidine as a DNA precipitating agent 7. 6 shoot per plate Keywords: Common bean, particle bombardment, tissue culture, hygromycin, GUS.