Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
489573		Visualization of interactions between fluorescently tagged G protein α11, α12/13 subtypes and adenosine 2A, dopamine 2 or homodimer adenosine 2A/2A receptors / Floresan işaretli G protein α11, α12/13 alt grubunun adenozin 2A, dopamin 2 veya homodimer adenozin 2A/2A reseptörleriyle etkileşiminin görüntülenmesi Yazar:IRMAK BEGÜM KOSTROMİN Danışman: DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2018 156 s.
G-proteine kenetli reseptörler (GPKR), G proteinlerle etkileşime girerek hücre dışı sinyalleri, hücre içi cevaplara dönüştüren hücre zarı moleküllerine ait büyük bir reseptör ailesidir. G proteinleri, ikincil mesajcılar ve sinyal proteinleri ile farklı sinyal yolaklarını düzenleyen moleküler düzenleyicilerdir. Adenozin 2A (A2A) ve Dopamin (D2) reseptörleri de G-proteine kenetli reseptör (GPKR) ailesine aittir ve daha çok striatopallidal γ-aminobutyric acid (GABA) içeren nöronlarda bulunur. Bu nedenle bu reseptörlerle ilgili problemler şizofreni, Parkinson gibi pisikolojik hastalıklarla bağlantılıdır. Adenozin A2A reseptörü, nörotransmisyonu, kardiyovasküler sistemi ve immun sistemini düzenler. Diğer bir yandan, Dopamin reseptörü ise hareket, gıda alımı, öğrenme, duygu ve davranış durumlarını kontrol eder. Yapılan çalışmalara göre A2A ve D2 reseptörleri cAMP seviyesini Gαs ve Gαi ptoteinleri aracılığıyla adenylyl siklazı uyararak ya da engelleyerek değiştirmektedir. Dopamin 1 (D1) ve Dopamin 2 (D2) reseptörleri heterodimer oluşturduklarında Gαq11 sinyal yolu tercih edilerek PIP2 ve DAG ikincil mesajcıları active ederler; ancak Gαq11 proteinin A2A, D2 ve A2A/A2A homodimeri reseptörleri ile etkileşimi rapor edilmemiştir. GPCR'lar aynı zamanda Rho kinazin aktive edilmesiyle aktin hücre iskeleti ve hücre göçünü düzenleyen Gα12/13 sinyal yolunu kullanır. Gα12/13 mutant hücrelerin aşırı nöral göçe ve serebral korteksin fonksiyon bozukluğuna neden olduğu tespit edilmiştir. Buna ek olarak, hücre göçü A2A reseptörü ile pozitif, D2 reseptörü ile negatif bir şekilde etkilenmektedir. Ancak, Gα12/13 proteinlerinin A2A ve D2 reseptörleri ile farklı bir sinyal yolu olarak etkileşimi olup olmadığı bilinmemektedir. Çalışmanın amacı; Gαq11-A2A, Gαq11-D2R, Gαq11-A2A/A2A; Gα12/13-A2A, Gα12/13 -D2R ve Gα12/13 -A2A/A2A arasında fiziksel etkileşimi Fluoresans Rezonans Enerji Transfer (FRET) metodu ile tespit etmektir. Bu amaçla G-proteinlerin α alt ünitesi (Gα11, Gα12 ve Gα13) mCherry veya EGFP floresant proteinleri ile beş farklı konumdan işaretlenmiş; reseptörler ise bölünmüş EGFP fragmenti ve EGFP floroforları ile işaretlenerek farkı kombinasyonlarda Mus musculus Neuroblastoma-2a (N2a) hürelerine transfekte edilmiştir. Proteinler arası etkileşimin görülmesi için spinning disk konfokal mikroskobu ile görüntüler alınmış ve FRET verimi ImageJ programının pixFRET eklentisi ile hesaplanmıştır. Gα11+mCherry ve D2R+EGFP ile Gα13+mCherry ve A2A+EGFP transfeksyonu gerçekleşen N2A hücrelerinin hücre membranından gelen yüksek FRET sinyali tespit edilmiştir. Gα13-D2R, Gα11-A2A ve Gα11-A2A/A2A çiftleri, Gα11-D2R ve Gα13-A2A protein çiftlerine göre daha az sinyal vermiştir. Bu proteinlerin kesin olarak etkileşime girdiğini belirlemek için daha fazla deneyle desteklenmesi gerekmektedir. Diğer bir yandan, Gα12-A2A ve Gα13-A2A/A2A çiftleri ise background sinyalden ayrılamayacak kadar düşük FRET sinyali vermiştir. Bu da etkileşimin olmadığının göstergesidir. Bu çalışmada olduğu gibi protein etkileşimlerinin çalışılması, sinyal yolaklarının daha iyi anlaşılmasına ve ileride bunların yeni tedavi modelleri ile ilaç adaylarının keşfedilmesine yardımcı olabilir.
G-Protein-coupled receptors (GPCRs) belong to one of the largest family of cell surface receptors, which transmit extracellular signals to intracellular responses by interacting with G- proteins. The G proteins are known as molecular switches that regulates different pathways via control of secondary messengers and signaling proteins. Adenosine 2A (A2A) and Dopamine 2 (D2) receptors belong to G-Protein-coupled receptors (GPCRs) family and are located mostly in striatopallidal γ-aminobutyric acid (GABA) containing neurons. Therefore, problems related to these receptors are associated with physiological disorders such as schizophrenia, and Parkinson disease. A2A receptors regulate neurotransmission, cardiovascular system and immune response; On the other hand, D2 receptors modulate the regulation of locomotion, food intake, learning, emotion and behavior. Studies showed that, A2A and D2 receptors change the cAMP level by stimulating or inhibiting adenylyl cyclase via interacting with Gαs and Gαi proteins. When D1 and D2 receptors heterodimerize, Gαq11 signal pathway was preferred and activate PIP2 and DAG secondary messengers. However, interaction between Gαq11 protein and A2A, D2R or A2A/A2A homodimer is not reported. GPCRs could also signal through Gα12/13 which regulates actin cytoskeleton and cell migration through activation of Rho kinases. It is established that, Gα12/13 mutant cells show neuronal over migration and dysfunction at cerebral cortex. In addition, cell migration is effected positively by A2A receptor activation while it could be negatively regulated by D2R receptor activation. However, it is not clear if Gα12/13 proteins are interacting with A2A and D2 receptors triggering related pathways. The aim of this study is to analyze possible physical interaction between Gαq11-A2A, Gαq11-D2R, Gαq11-A2A/A2A; Gα12/13-A2A, Gα12/13 -D2R and Gα12/13 -A2A/A2A using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) method. For this purpose, G-protein α subunits (Gα11,G α12 and Gα13) were labeled with mCherry or EGFP fluorescent proteins from five different internal locations; receptors were labelled with split-EGFP fragments, and full length EGFP fluorophore, and then transfected to Mus musculus Neuroblastoma-2a (N2a) cells as various combinations. To analyze the possible interactions, images were taken via spinning disc confocal microscopy and FRET efficiency was calculated by using pixFRET Plugin for ImageJ software. Images obtained from Gα11+mCherry and D2R+EGFP transfected N2a cells; Gα13+mCherry and A2A+EGFP have high FRET signal mostly located on cell membrane. Gα13-D2R, Gα11- A2A and Gα11-A2A/A2A pairs had lower signal than Gα11-D2R and Gα13-A2A pairs. Further experiments are necessary to prove an interaction between these pairs if it ever exists. On the othe hand Gα12-A2A and Gα13-A2A/A2A pairs had very low signal that was impossible to difrentiate from background signal indicating a lack of interaction. Protein interaction studies like the ones detailed in this study could help us understand signal transduction pathways much better, thus will be useful to design new treatment models and discover drug candidates in future.