Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
439578		A genetic analysis of autoinflammatory diseases / Otoenflamatuar hastalıklarda genetik analiz Yazar:AYŞE BALAMİR Danışman: PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine Dizin:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2016 114 s.
Otoenflamatuar hastalıklar, kalıtsal periyodik ateş sendromları olarak da bilinen tekrarlayan ateş atakları, raş, serozit, lenfadenopati ve artritgibi semptomlarla karakterize edilmiş olup doğal immün sistemin disregülasyonu sonucu oluşmaktadır. Patogenezde otoantikor yapımının olmayışı ve otoreaktif T hücrelerinin bulunmayışı proinflamatuvar bir durum oluşturarak inflamazom aktivasyonuyla sonuçlanır. Benzer klinik bulgulara sahip otoinflamatuar sendromların bazısı otozomal dominant olarak kalıtılırken bazıları da otozomal resesif geçiş gösterir. Genellikle çocukluk çağında ortaya çıkan nadiren daha geç başlayan otoinflamatuvar hastalıklar çok nadir görülür. Kavram ilk kez 1999 yılında McDermott ve arkadaşları tarafından açıklanmış olup bugüne kadar otoinflamatuvar hastalıklarla ilişkilendirilmiş 25 gen bölgesi Infevers veritabanında gösterilmiştir. Ailesel Akdeniz ateşi (FMF), Tümör Nekrozis Faktör Reseptör İlişkili Periyodik Sendrom (TRAPS), Cryopyrin İlişkili Periyodik Sendromlar (CAPS), Mevolenat Kinaz Eksikliği (hiper IgD sendromu-HIDS), Blau Sendromu (BS), Adenosine Deaminase Deficiency (DADA2), NLRP12 İlişkili Otoinflamatuar Bozukluklar (ailesel soğuk otoinflamatuar sendrom 2) (FCAS2), İnterlökin 1 Reseptör Antagonisti Eksikliği (DIRA) ve Piyojenik Artrit, Piyoderma Gangrenozum, Akne (PAPA) sendromu, Majeed Sendromu (kronik tekrarlayan multifokal osteomiyelit), (MS) monogenik hastalık grubunun içinde bulunmaktadır. Toplumumuzda en sık görülen otoinflamatuar hastalık olan FMF tekrarlayan kısa süreli ateş ile birlikte karın, eklem ve göğüs bölgelerinde ağrı şeklinde ortaya çıkan deri lezyonları ile karakterizedir. Otozomal resesif gösteren bu hastalıktan sorumlu MEFV geni üzerinde şimdiye kadar 308 varyant tanımlanmıştır. Bunlar arasından M694V, M680I, V726A, M694I ve E148Q FMF'de tespit edilen başlıca varyasyon tiplerinin %70 ini oluşturmaktadır. Kalıtsal periyodik ateş sendromları içerisinde ikinci en sık görülen hastalık olan TRAPS, otozomal dominant geçiş gösterirken, tekrarlayan ateş ve inflamatuar ataklarla karakterize edilmiştir. Amiloidoz ciddi komplikasyon oluşturarak hastaların 10% nda görülmektedir. Tanı genellikle tümör nekrozis faktörü (TNF) kodlayan TNFRSF1A geninin ekson 2, 3 ve 4 bölgelerini kapsayan DNA analiziyle mutasyonlar saptanarak konulur. Sendrom, tüm gene yayılmış olarak görülen yaklaşık 145 varyasyon ile ilişkilendirilmiştir. Bir diğer otoinflamatuar hastalık olan CAPS üç form altında toplanmıştır; Ailesel Soğuk Otoinflamatuvar Sendom (FCAS), Muckle–Wells Sendromu (MWS) ve Kronik İnfantile Nörolojik Kutanöz Artiküler Sendrom (CINCA) (veya diğer ismiyle Neonatal Başlangıçlı Multisistemik İnflamatuvar Hastalık (NOMID). Döküntü, ateş, üşüme, eklem ağrısı, yorgunluk ve göz kızarıklığı dahil olmak üzerebenzer klinik semptomlar gösteren bu alt tiplerin sorumlu gen bölgesi NLRP3 adı verilen proteini kodlayan CIAS1 isimli gendir.Otozomal dominant geçiş gösteren bu hastalıkların sorumlu gen bölgesinin 3. ekzonu üzerinde bugüne kadar 176 varyasyon tanımlanmıştır. Bunlar arasından T433I, A242A, V198M toplumumuzda sıkça rastlanan mutasyonlardır. Otozomal resesif geçiş gösteren HIDS, hastalarda tekrarlayan nedeni bilinmeyen ateş, eklem ağrıları veyükselmiş serum IgD seviyesi ile birlikte kendini göstermektedir. Mevolenat kinaz enziminin sentezinden sorumlu MVK geni üzerinde 203 varyasyon hastalığın patolojisi ile ilişkilendirilmiş olup özellikle V377I ve L234P mutasyonları hastalarda en sık görülenler arasında yer almaktadır.Çocukluk yaş grubunda başlayan Blau sendromu otozomal dominant geçiş gösterir ve erken başlangıçlı sarkoidoz olarak da bilinmektedir. NOD2/CARD15 sorumlu genin ekzon 4 bölgesinde bulunan mutasyonlarla ilişkilendirilmektedir. Otozomal resesif kalıtılan bir diğer hastalık olan ADA 2 sendromu ateş, nörolojik bozukluklar, döküntü ve sistemik vaskülopati ile karakterizedir. CECR1 geni üzerinde yaklaşık 24 varyant tanımlanmış olup mutasyonlar genellikle genin ekzon 2, 3, 4, 5, 6, 9 bölgelerinde sıkça saptanmaktadır. Majeed sendromu, otozomal resesif geçiş gösteren hastalık olup LPIN2 geni üzerindeki mutasyonlarla ilişkilendirilmektedir. İnterlökin 1 reseptör antagonisti eksikliği (DIRA) sistemik bulgular, osteolitik lezyonlar, periosteit ve püstüler döküntü ile karakterize, otozomal resesif geçiş gösteren hastalıktır. IL-1 reseptör antagonist proteinini kodlayan IL1RN geni üzerindeki 13 mutasyonla ilişkilendirilmektedir. Bir diğer piyojenik inflamatuar bozukluk olan otozomal dominant olarak kalıtılan PAPA sendromu, hastalıktan sorumlu prolin serin treonin fosfataz ilişkili protein 1'i kodlayan, PSTPIP1 geni üzerinde 23 varyantla tanımlanmıştır. Nadir olarak görülen FCAS2 sendromu ise otozomal dominant geçiş gösteren, işitme kaybının ve lenfadenopati ile tekrarlayan epizodik ateşler ile ürtiker benzeri eritem, artralji, miyalji, baş ağrısı gibi semptomlarla karakterize edilmiştir. Hastalık, NLRP12 geni üzerinde bulunan yaklaşık 34 varyasyonla ilişkilendirilmiştir. Hastalıkların klinik bulgularındaki benzerlikler hastalara kesin tanı konmasını zorlaştırmaktadır. STING ilşkili vaskülopati (SAVI), bebeklik çağında başlayan olağandışı inflamasyon sonucu oluşan özellikle deri, kan damarları ve akciğerlerde karakterize edilmiştir. Hastalık otozomal resesif geçiş gösterip, TMEM173genin ekzon 5 bölgesindeki 4 mutasyonla ilişkilendirilmiştir. Genetik testler ile hastalıkların moleküler düzeyde anlaşılması ve klinik tanının kesinleştirilmesi önem kazanmaktadır. Bu amaç ışığında, İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı Romatoloji Polikliniği ve İstanbul Teknik Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü ile ortaklaşa yürüttüğümüz kesin tanısı konamayan, otoinflamatuar hastalık bulguları bulunan 140 bireyde sorumlu gen bölgeleri üzerinde varyasyon/mutasyon analizi yapılmıştır. Etik kurul onayı ve çalışmaya katılan her bir bireyden yazılı onam alındıktan sonra kan örnekleri toplanmıştır. Herbir hasta için 2 cc'lik kandan genomik DNA izole edildikten sonra polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile spesifik ekzon bölgeleri çoğaltılmıştır. Bu PZR ürünleri pürifikasyon sonrası doğrudan dizi analizi yapılarak incelenmiştir. Bu hastalıklarla ilişkilendirilmiş genler (MEFV, TNFRSF1A, NLRP3, MVK, NOD2, CECR1, NLRP12, PSTPIP1, LPIN2 ve IL1RN) ve üzerinde mutasyon taşımayan, birden fazla mutasyon taşıyan veya birden fazla gende mutasyon taşıyan hastalar ve varyasyonları bulunan sağlıklılarsaptanmıştır. Bu bulguları yeni nesil dizileme yöntemleriyle karşılaştırmak için 11 hasta seçilmiş ve bu yöntemle hastalıkla ilişkilendirilmiş diğer otoinflamatuvar genler üzerindeki varyasyonlar paralel dizileme (aynı anda çok sayıda dizileme) ile belirlenmiştir. Sanger ve Miseq dizi analizi sonuçları karşılaştırılarak klinik heterojenite gösteren hastalara kesin tanı konmasına yardımcı olunmuştur. Bununla birlikte panelden seçilen 16 hastada mutasyon/varyasyon analizi Illumina IONS yeni nesil dizileme yöntemiyle 15 gen üzerinde yapılmıştır. E943G, V928I, G144V, V325I, R262H, R253W, R253Q, H244R, I671V, L281P, S420L, R159G, C890R, A160T patogenik mutasyonlar sırasıyla NOD2, MVK, TMEM173, PSTPIP1, PLCG2, CARD14, LPIN2, NLRP12, SLC29A3, IL10R, NLRC4 genleri üzerinde bulunmuştur. Bu nadir görülen varyantlar daha once Sanger sekanslama tekniğiyle aydınlatılmamış olup, paralel bir şekilde bir çok dizilimlemeyi aynı anda gerçekleştirmiştir. Elde edilen mutasyon oranları, daha once Sanger dizileme ile bulunan sonuçlarla karşılatırıldığında TRAPS tanılı hastalarda 3% den 25% e, HIDS tanılı hastalarda 23% den 50% e, ADA2 sendromlu hastalarda ise 24% den 33% e olan bir artış gözlemlenmiştir. Bu sonuçlarla hastalara kesin tanının konmasında IONS yeni nesil dizileme yönteminin daha efektif olduğunu göstermiş olmaktayız. Ayrıca elde edilen mutasyon sonuçları ile Türk toplumunda otoinflamatuar gen mutasyon sıklığı da belirlenmiştir. Bu çalışmada disiplinler arası bir yaklaşım izlenerek genetik ve biyoinformatik analizler ile literatürde ilişkilendirilmiş gen varyantlarını belirlemiş bulunmaktayız.
Autoinflammatory diseases, also known as hereditary periodic fever syndromes which are characterized by symptoms such as recurrent fever, rash, serositis, lymphadenopathy and arthritis allowed by dysregulation of innate immune system. Absence of autoreactive T cells and lack of autoantibodies production in the pathogenesis cause proinflammatory condition resulting in activation of inflammasome. Some of autoinflammatory syndromes having similar clinical findings are inherited as an autosomal dominant wheares others autosomal recessive. These autoinflammatory diseases usually have an early onset in childhood. The concept of diseases first described by McDermott et al in 1999. Since then, disease related 25 gene regions have published in INFEVERS database. Familial Mediterranean fever (FMF), TNF-receptor-associated periodic syndrome (TRAPS), Cryopyrin associated autoinflammatory syndromes (CAPS), hyperimmunoglobulinemia-D with periodic fever syndrome (HIDS), neonatal onset multisystem inflammatory disorder/ chronic infantile neurological cutaneous and articular syndrome (NOMID/CINCA), familial cold autoinflammatory syndrome (FCAS), Muckle-Wells syndrome (MWS), Blau sendromu (BS), Majeed syndrome (MS) and pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum a acne (PAPA) syndromehave been grouped as monogenic disorders. Clinical diagnosis can be difficult in cases where there are similar clinical manifestations. Most of the times definite diagnosis requires genetic testing, which also provides a better understanding of the molecular mechanisms and theurapatic interventions. In this purposes, commonly seen 131 clinically not-definitive autoinflammatory disorders patients from our region were analysed for genetic mutations. The clinical sample were provided from Departments of Internal Medicine, and Pediatric Rheumatology Clinics mainly from Cerrahpasa Medical Faculty. Blood samples were collected after ethics committee approval and written informed consent from each individual participating in this study were obtained. Spesific exon regions for the known genes were amplified by polymerase chain reactions (PCR) after genomic DNA isolation from 2 cc of blood sample for each patient. PCR products were examined through Sanger sequencing after purification. Genetic analysis were applied for FMF, TNFRSF1A, NLRP3, MVK, NOD2, CECR1, NLRP12, PSTPIP1, LPIN2 and IL1RN in individual genes or in combination of more than one gene based on the clinical information. Further next generation sequencing (NGS) using Illumina and IONS5 platforms were applied in selected genes coding regions in a subset of 43 patients and compared with Sanger sequencing results. Sanger sequencing results correlated with Miseq sequence analysis in 11 patients in our cohort. However more detailed IONS sequencing in a 15 gene panel revealed more information. As a result we have identified E943G, V928I on NOD2 gene; G144V, V325I on MVK gene; R262H, R253W on TMEM173 gene; R253Q on PSTPIP1 gene; H244R, I671V on PLCG2 gene; R189W, E185K, R862W on CARD14 gene; E601K, P626S on LPIN2 gene; F402L on NLRP12 gene; L281P on SLC29A3 gene; R261W, S420L, R159G on IL10R gene; C890R, A160T on NLRC4 gene in autoinflammatory disorders, which clarified definitive diagnosis and therapeutic interventions. As a conclusion use of NGS with a wide panel of relevant genes in comparison of to Sanger sequencing for known exons, increased the definitive diagnosis 3% to 25% in TRAPS, 23% to 50% in HIDS and 24% to 33% in ADA2 deficiency patients.