Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
352438		A study on the localization of alternative MEFV transcripts in neutrophil-like cells / MEFV alternatif transkriptlerinin nötrofil benzeri hücrelerde lokalizasyon çalışması Yazar:ŞULE ERDEMİR Danışman: DOÇ. DR. EDA TAHİR TURANLI Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı Konu:Genetik = Genetics Dizin:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2013 87 s.
Ailesel Akdeniz Ateşi (AAA) hastalığı, genellikle Akdeniz toplumlarını (Yahudiler, Araplar, Türkler, Ermeniler, vb.) etkileyen inflamatuar bir hastalıktır. Çoğunlukla peritonite eşlik eden ateş atakları ile kendini göstermektedir. AAA hastalığının geni olan MEFV; 16. kromozomun kısa kolunun 15kb?lık kısmını kapsar. MEFV, nükleer efektör moleküllerin, onkojenezi, embriyonik gelişimi, inflamasyonu ve hematopoezi düzenleyen nükleik aside bağlanan proteinlerin yer aldığı, büyük ölçüde korunmuş bir gen ailesine aittir. 10 adet ekzon içeren bu gen 3.7 kb?lik bir transkript oluşturur ve 781 adet amino asitten oluşan pyrin/marenostrin (P/M) proteinini kodlar. Tam mekanizması bilinmemekle birlikte, P/M proteininin inflamasyon yolağındaki önemi belirlenmiştir. P/M proteini; nötrofiller, eozinofiller, monositler, dendritik hücreler ve sinoviyal fibroblastlarda üretilmektedir. MEFV ekspresyonu; interferon ? (IFN-?), tümör nekrozis faktör ? (TNF-?), lipopolisakkarid (LPS) ve interlökin 1ß (IL-1ß) gibi proinflamatuar ajanlar ile artar. Bugüne kadar, MEFV geni üzerinde 246 varyasyon belirlenmiştir. Bunların 119 tanesi AAA hastalığı ile ilişkili bulunmuştur. Gen üzerindeki mutasyonlar; ekzon 1, 2, 3, 5, 9 ve 10?da yer alır. Mutasyonlar için iki adet sıcak bölge belirlenmiştir: Bunlardan bir tanesi ikinci, diğeri de onuncu ekzondur. En çok görülen beş mutasyon ise şunlardır: İkinci ekzonda yer alan E148Q, onuncu ekzonda yer alan M694V, M680I, M694I ve V726A. 86 kDa?luk pyrin proteini, 5 bölgeden oluşur: N-ucundaki pyrin (PYD) bölgesi, bZIP, B-box, coiled-coil bölgesi, and C-ucundaki B30.2 (PRYSPRY) bölgesi. Her bölgenin protein-protein etkileşimlerinde farklı bir görevi vardır. Örneğin; sitokin salınımı, transkripsiyonel düzenleme, hücre iskeleti sinyali ve hücre ölümü düzenlenmesi vasıtasıyla oluşan inflamasyon bağlantılı proteinlerle etkileşmektedir. Protein çeşitliliğinin artırılmasını sağlayan mekanizmalardan biri olan alternatif kırpılma, aynı öncül mRNA?dan 5? ve 3? kırpılma bölgelerinin farklı birleşimleriyle birden fazla mRNA elde edilmesidir. İnsanlarda, çok sayıda ekzon içeren genlerin %95?inde alternatif kırpılma gerçekleşmektedir. Alternatif kırpılma 6 tipte gruplandırılabilir: (1) kaset-tipi alternatif ekzonlar; (2) ekzon dizileri içerisindeki 5? ya da 3? kırpılma bölgelerinin alternatif seçilimi; (3) karşılıklı hariç tutulan ekzonlar; (4) intron koruma; (5) alternatif promotörler; (6) alternatif poliadenilasyon. İnsanlarda, daha çok ekzon atlama tipindeki alterantif kırpılma görülmektedir. Alternatif kırpılmayla oluşmuş 15 adet MEFV transkripti bulunmaktadır: Tam boy (fl), 2? (d2), 2a, 4a, 8ext, 2?/4a, 2?/8ext, 2?/9ext, 2a/4a, 2a/8ext, del2.3.4, del2.3.4 del7, del2.3.4 del7.8, del2.3.4.5, del3.4 del7.8. Alternatif MEFV transkriptleri arasında yalnızca yedi tanesi proteine çevrilmektedir: Fl, 2?, 2?/8ext, 2?/9ext, 8ext, 2a, 2a/4a. Grubumuzun gerçekleştirdiği önceki bir çalışmada ekzon 2-kırpılmış formun (2?) ekspresyonunun, AAA hastalarında sağlıklı kontrollere göre anlamlı ölçüde yüksek olduğu gösterilmiştir (p=0.026). Son dönemde yapılan çalışmalarda, tam boy ve 2? (Ekzon 2-kırpılmış) formlarındaki pyrin/marenostrin proteinlerinin hücre içi lokasyonları belirli hücrelerde araştırılmıştır. Bu çalışmaların ilkinde; COS-1 hücrelerinde tam boy pyrin/marenostrin proteininin lokalizasyonunun sitoplazmada olduğu tespit edilmiştir. Diğer bir çalışmada; CHO hücrelerinde, tam boy pyrin/marenostrinin sitoplazmada lokalize olurken, 2? formunun nukleusta yer aldığı gösterilmiştir. Bir başka çalışmada; bu iki formun en sık görülen MEFV mutasyonları taşıyan ve taşımayanlarının HeLa hücrelerindeki lokalizasyonu karşılaştırılmıştır. Ancak bu mutasyonların lokalizasyonda bir değişikliğe sebep olmadığı ve tam boy pyrin/marenostrinin sitoplazmada, ekzon-2 kırpılmış formun (2?) ise nukleusta olduğu gözlenmiştir. Lokalizasyonla ilgili yapılan en yeni çalışmada ise sinoviyal fibroblastlara transfekte edilen myc-etiketli tam boy pyrin/marenostrinin sitoplazmada, myc etiketli-2? izoformunun ise yalnızca nukleus içerisinde değil, hatta daha sık olarak sitoplazmada lokalize olduğu gösterilmiştir. Bunun yanında doğal pyrin/marenostrin proteininin çoğunluğu tam boy formdan oluştuğu halde, doğal protein sinoviyal fibroblastlarda, nötrofillerde ve dendritik hücrelerde ağırlıklı olarak nukleusta, monositlerde ise sitoplazmada saptanmıştır. Bu bulgular bize MEFV-2? formunun hastalık patolojisinde rolü olduğunu varsaymamızı sağladı. Bu amaçla tam boy ve 2? izoformunu içeren GFP-etiketli 2 adet plazmid ilk olarak HL-60 (İnsan promiyolositik lösemi hücreleri) hücre hattına transfekte edildi ve proteinlerin lokalizasyonu konfokal mikroskop aracılığıyla saptandı. Daha sonra HL-60 hücreleri DMSO ile inkübe edilip nötrofil-benzeri hücrelere farklılaştırıldı. 0.5-2x105 hücre/mL olacak şekilde dört farklı hücre başlangıç sayısı kullanıldı. 6 gün boyunca %1.25, %1.5 ve %1.75 oranlarında DMSO uygulaması yapıldı. İnkübasyonun ilk üç gününde FBS içermeyen medya kullanıldı. İnkübasyon sonrası, poly-L-lysine kaplı her lamele 3x105 hücre ekildi. 24 saat sonra DAPI ile boyanarak konfokal mikroskop yardımıyla farklılaşma oranı incelendi. En iyi sonuç 0.5x105 hücre/mL ile başlanan inkübasyondan elde edildi. ~ %40 oranında bir farklılaşma görüldü. Hücre farklılaşması akım sitometri yöntemi ile de doğrulandı. Farklılaşma belirteçi olarak CD44 antijeni seçildi. Hücre-hücre etkileşiminde, hücre adezyonu ve hücre göçü olaylarında yer alan bir hücre yüzeyi glikoproteini olan CD44; hemopoetik hücreler de dahil olmak üzere birçok hücre tipinde üretilmektedir. DMSO ile inkübe edilerek nötrofile doğru farklılaştırılan HL-60 hücrelerindeki CD44 ekspresyonunun düşüşü, normal granülosit oluşumu sırasındaki CD44 azalması ile uyumludur. Bu nedenle HL-60 ve DMSO uygulanmış HL-60 (nötrofil-benzeri hücreler) hücreleri CD44 ekspresyonu açısından karşılaştırıldı. Bunun sonucunda DMSO ile inkübe edilmiş hücrelerde CD44 kaybına rastlandı. Daha sonra farklılaştırılan bu hücreler de aynı plazmidler ile transfekte edildi ve proteinler konfokal mikroskopi tekniğiyle gözlemlendi. Bu çalışmada kullanılan HL-60 hücre hattı; all-trans retinoik asit (ATRA), Dimetil Sülfoksit (DMSO), 1?,25-dihidroksivitamin-D3, forbol ester türevleri (TPA) gibi ajanların uygulanması ile nötrofil, monosit ve makrofajlara dönüşebilme özelliklerine sahip süspansiyon bir kültürdür. Malign hücrelerin özelliklerini gösterir ve onkogenleri eksprese eder. Farklılaşmamış HL-60 hücreleri; geniş bir çekirdeğe ve çoklu azurofilik granüllere sahip bazofilik bir sitoplazmaya sahiptir. DMSO uygulamasıyla farklılaşabildiği nötrofiller ise; at nalı veya segmentli/loblu bir çekirdeğe sahiptir. Sitoplazması içerisinde ise küçük ve açık pembe granüller dağılmış durumdadır. Farklılaşma esnasında, HL-60 hücrelerinin çoğalmaları durur, yeni genler eksprese etmeye başlar, morfolojik değişime uğrarlar ve sonunda da apoptoza giderler. Bununla birlikte, pyrin proteinin her iki formunun hücre içerisindeki lokalizasyonları western-blot tekniği ile doğrulanmak istendi. Bunun için her iki plazmid de aynı hücreye verilerek (hem HL-60, hem de nötrofile farklılaştırılan hücreler) ikili transfeksiyon yapıldı. Traansfeksiyondan 24 saat sonra, DMSO uygulanmış ve uygulanmamış hücrelerden total, sitoplazmik ve nükleer protein izolasyonları gerçekleştirildi. Ancak western-blot sonucunda sitoplazmik ve nükleer proteinlerin birbirinden ayrılamadığı görüldü. Bunun kontorolü sitoplazmik bir protein olan b-actin ve nüklear bir protein olan histone-h3 antikorları ile gerçekleştirildi. Bu çalışma sonucu elde ettiğimiz bulgular; tam boy proteinin HL-60 hücrelerinde sitoplazmada lokalize olurken, ekzon 2-kırpılmış formun nukleus içerisinde olduğunu göstermiştir. Öteki taraftan, nötrofil benzeri hücrelerde durum HL-60 hücrelerindekinden farklı bir tablo çizmiştir ve her iki form da sitoplazma içerisinde lokalize olmuştur. MEFV-d2 formunun nötrofil benzeri hücrelerde nukleus içerisinde lokalize olamaması ve bununla birlikte bu formun AAA hastalarında ekspresyonunun yüksek olduğu düşünüldüğünde elde edilen bulgular bu izoformun AA hastalığındaki patolojik rolü hakkındaki hipotezimizi güçlendirmektedir. Bu çalışmanın başka hücre tiplerinde de tekrarlanması gerekmektedir. Örneğin MEFV ekspresyonuna sahip ve inflamasyonda görev alan monositik hücre hatları (THP-1, U937, vb.), bu iki formu taşıyan plazmidlerle transfekte edilerek nötrofil-benzeri hücrelerdeki lokalizasyon durumuyla karşılaştırılmalıdır. Bununla birlikte protein deteksiyonu, sitoplazma ve nukleusu birbirinden düzgün bir biçimde ayırabilecek farklı yöntemler uygulanarak tekrarlanmalıdır. Bu çalışmayı desteklemek amacıyla in vitro infeksiyon modeli oluşturulup tam boy ve ekzon 2-kırpılmış formların loklaizasyonları araştırılabilir.
Familial Mediterranean Fever (FMF) is an inflammatory disease which generally affects people of Mediterranean heritage. It is characterized by attacks of fever with serositis. MEFV, which is gene of FMF, spans a 15-kb interval on chromosome 16p, contains 10 exons that comprise a 3.7-kb transcript, and encodes a 781? amino acid protein named pyrin/marenostrin (P/M). Although the exact mechanism of pyrin/marenostrin is not known, its importance in the inflammatory pathway is well established. P/M is expressed in neutrophils, eosinophils, monocytes, dendritic cells and synovial fibroblasts. Alternative splicing, which is one of the mechanisms that increases protein diversity, is the process by which multiple mRNAs can be generated from the same pre-mRNA by the differential joining of 5? and 3? splice sites. There are fifteen MEFV transcripts which are generated by alternative splicing: full-length (fl), 2? (d2), 2a, 4a, 8ext, 2?/4a, 2?/8ext, 2?/9ext, 2a/4a, 2a/8ext, del2.3.4, del2.3.4 del7, del2.3.4 del7.8, del2.3.4.5, del3.4 del7.8. Among these MEFV alternative transcripts only seven transcripts can be translated to proteins: Fl, 2?, 2?/8ext, 2?/9ext, 8ext, 2a, 2a/4a. A previous study carried out by our group has shown that exon 2 deleted form (2?) in FMF patients is expressed significantly higher compared to healty controls (p=0.026). The subcellular localization of full-length P/M and P/M-2? isoform was investigated in several cell lines and in literature these studies showed that full-length P/M was cytoplasmic and 2? isoform was nuclear except one study. This study indicated that myc-tagged 2? was not exclusively nuclear and were more often cytoplasmic in synovial fibroblasts. It also showed that native P/M which consists of predominantly full-length type, was predominantly nuclear in synovial fibroblasts, neutrophils, and dendritic cells, but was cytoplasmic in monocytes. Moreover, the localization of P/M-fl and P/M-2? was not affected by most frequent MEFV mutations. These findings have led us to hypothesize the role of MEFV 2? isoform in the disease pathology. To this end two GFP-tagged plasmids which are MEFV-fl-GFP and MEFV-d2-GFP were transfected to HL-60 (Human promyelocytic leukemia cells) cell line first, and their localization were detected with confocal microscope. Subsequently, HL-60 cells were differentiated to neutrophil-like cells via DMSO. Cell differentiation was confirmed via flow cytometry assay. These cells were also transfected with same plasmids and proteins were observed through confocal microscopy technique. Our results showed that MEFV-fl-GFP was localized in cytoplasm of the cell and MEFV-d2-GFP was localized in nucleus of HL-60 cell line. On the other hand, both MEFV-fl-GFP and MEFV-d2-GFP were localized in cytoplasm of neutrophil-like cells. Inability of MEFV-d2-GFP form to localize into nucleus in neutrophil-like cells in vitro together with its high expression in FMF patients in vivo strenghten our hypothesis of MEFV exon 2 deleted transcripts pathologic role in FMF.