Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
435866		CRISPR-Cas9 based investigation of chromatin modifiers in human somatic cell reprogramming / CRISPR-Cas9 aracılığı ile kromatin modifiye eden genlerin insan hücre yeniden programlanmasında incelenmesi Yazar:CAN Danışman: YRD. DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER Yer Bilgisi: KOÇ ÜNİVERSİTESİ / FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ / BİYOMEDİKAL BİLİMLER VE MÜHENDİSLİK ANABİLİM DALI Konu:Moleküler Tıp = Molecular Medicine Anahtar Kelime:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2016 145 s.
Somatik hücrelerin Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc transkripsiyon faktörleri ile pluripotensiye yeniden programlanması, epigenomun kromatin modifiye edenler aracılığıyla yeniden biçimlenmesiyle gerçekleşir. Bu bağlamda çalışılan genlerin bazıları yeniden programlamanın bariyer ve gerekli genleri olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte gelişen protokollerle yapılan geniş kapsamlı çalışmaları, yeniden programlanmanın beraberinde gelen shRNA verktörlerinin susturulmaya duyarlılığı ve bu genlerin knockout olduğu insan hücre hatlarının bulunmaması sınırlandırıyor. Böylece, yeniden programlanmanın farklı evrelerinde bu genlerin kalıcı modifikasyonuyla CRISPR-Cas9 knockout kütüphanesi kullanarak kromatin modifiye edenlerin sistematik incelenmesi hipotezini belirledik. Bu amaçla, 247 histon ve DNA modifiye eden kromatin yeniden düzenleyiciler, yazıcılar, okuyucular ve siliciler içeren kromatin modifiye edenlerin CRISPR-Cas9 kütüphanesi oluşturuldu. Ardından bu kütüphane, heterojen hücre popülasyonu oluşturulması ve sonrasında OSKM ile yeniden programlanmaya tabi tutulmasında kullanıldı.Bunun için, FACS aracılığıyla ayrıştırılmış Tra-1-60 pozitif ve retroviral yolla eksojen olarak üretilen yeşil floresan proteinleri (EGFP) susturulmuş hücrelerden elde edilen uPKH'lerden farklı zaman aralıklarında toplanılanlar kullanıldı. İzole edilen hücrelerde CRISPR rehber RNA'ların miktarı ileri nesil sekanslama yöntemi ile belirlendi. Spesifik rehber RNA'ların çokluğunun analizi, önceden çalışılmış ve ispatlanan somatik hücrelerin yeniden programlanmasının düzenleyicilerini doğruladı ve farklı dönemlere özgü yeni bariyer ve gerekli düzenleyiciler saptandı. Bunlardan PAXIP1, BRD2 ve USP22 bariyer ve CHAF1A, KDM8 ve PRMT5 gerekli düzenleyiciler olarak belirlendi. Üstelik gen kümelerinin işleve dayalı analizi, MLL komplekslerinin yeniden programlanmanın muhtemel bariyeri, BAF, SWI/SNF ve MOZ/MORF komplekslerinin de önemli düzenleyiciler olarak görev aldıklarını açıkladı. Tarama sonuçlarına dayanarak, farklı dönemlere özgü inhibitörlerin kombinasyonlarının kullanılmasının, yeniden programlanmayı hızlı ve daha verimli hale getirdiği görüldü. Bu çalışma yeniden programlamanın kromatin bazlı engellerinin açıklanmasına ve daha verimli yeniden programlama yolları için rehber olacaktır.
Reprogramming of somatic cells to pluripotency via four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (OSKM) involves extensive remodeling of the epigenome which is carried out by a number of chromatin modifiers. A number of these genes have been studied in the context of reprogramming and defined as barriers or essential regulators of this process. However, established protocols limit a comprehensive examination due to the susceptibility of shRNA vectors to proviral silencing which accompanies reprogramming, and the unavailability of human knock-out cell lines. Therefore, we hypothesized that pooled CRISPR-Cas9 knock-out libraries can enable systematic investigation of chromatin modifiers and reveal their role in different steps of reprogramming by enabling permanent gene modifications. To this end, we constructed a CRISPR-Cas9 knock-out library targeting the 247 chromatin modifiers including chromatin remodelers, writers, readers and erasers of histone and DNA modifications. We utilized this library to generate heterogeneous cell populations harboring putative chromatin modifier knock-outs, which were then reprogrammed with the delivery of OSKM. FACS-based enrichment of TRA-1-60 positive cells, and low copy exogenous retroviral EGFP silencing was utilized to collect emerging iPSCs at different time points of reprogramming. The abundance of CRISPR guide RNAs in isolated cells were determined by next generation sequencing. Analysis of relative enrichment of specific guide RNAs confirmed the majority of the known reprogramming regulators and identified novel stage specific barriers and essential regulators for human somatic cell reprogramming. These include PAXIP1, BRD2 and USP22 as barriers, and CHAF1A, KDM8 and PRMT5 as essential regulators. In addition, functional analysis based on class of genes revealed that various MLL complexes act as barriers, and BAD, SWI/SNF, and MOZ/MORF complexes act as essential regulators for reprogramming. Based on the screen results, stage specific combinatorial use of small molecule inhibitors enabled accelerated and more synchronous efficient reprogramming. Taken together this study establishes roadblocks of reprogramming through chromatin landscape, and can guide more efficient reprogramming strategies to be formulated.