Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
472858		Investigation of NFIB binding to CDO and FGF19 gene regulatory regions by chromatin immunoprecipitation / NFIB'nin CDO ve FGF19 gen düzenleyici bölgelerine bağlanmasının kromatin immün çöktürme yöntemiyle araştırılması Yazar:CEMRE LEKTEMUR Danışman: YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics Dizin:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2017 93 s.
Nükleer faktör I transkripsiyon faktörü ailesi NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX olmak üzere 4 üyeden oluşmaktadır. İki adet aynı ya da farklı NFI proteinleri DNA ipliğinde TTGGC(N5)GCCAA dizisine bağlanmaktadır. NFI proteininin (N) ucunda yaklaşık 210 amino asit uzunluğunda DNA bağlanma ve dimerleşme bölgesi, karboksi (C) ucunda ise gen ifadesini aktifleştiren veya baskılayan C ucu domeni bulunmaktadır. NFI proteinleriarasında amino asit dizilerinin benzerliği araştırıldığında, özellikle N-ucu domeninin benzerliğinin yüksek oranda korunduğu, N-ucunun aksine C-ucu domeninde benzerliğin daha az olduğu görülmektedir, bu durum NFI proteinlerine çeşitlilik sağlamaktadır. Bunun yanı sıra, alternatif kırpılma mekanizmaları sonucunda farklı NFI izoformlarının üretilmesi,NFI proteinlerinin çeşitliliğini arttırmaktadır. NFI proteinlerinin diğer proteinler ile benzerliğine bakıldığında, sadece SMAD proteinlerinin N-ucu bölgesinde bulunan MH1 motifiile benzerlik görülmüştür. Her iki transkripsiyon faktörü de korunmuş sistein-sistein-histidin-sistein, CCHC, amino asit dizisini içermektedir ve bu dizi DNA'ya bağlanma özelliği kazandırmaktadır. Merkezi sinir sisteminde embriyonik dönemde NFIA, NFIB ve NFIX nöral progenitor hücrelerinin bulunduğu ventriküler bölgelerde, nöronlarda ve glialarda ifade edilirken, yetişkin dönemde ise nöral kök hücrenin ve projenitor hücrelerinin lokalize olduğu subventriküler zonda bulunmaktadır. NFIC ifadesinin düşük olması nöronal gelişimde önemli bir rol oynamadığını göstermektedir. In vivo çalışmalar nöral NFI ifadelerinin susturulmasının, beynin farklı bölgelerinin (hipokampüs, neokorteks, arka beyin, gibi) gelişimini (nöronal farklılaşma, nörogenez, gliogenez, akzonal uzama ve hücre migrasyonu) etkilediğini göstermiştir. NFI proteinleri tarafından transkripsiyonu aktive olan genler farklılaşma, gliogenez, dendrit ve akson oluşumu ile ilgili mekanizmlarda rol oynarken; transkripsiyonu baskılanan genlerin kök hücrenin kendini yenilemesi veya projenitör hücrenin kendini sürdürmesi ile ilgili olduğu görülmüştür. Yetişkin kök hücrelerde ise embriyonik kök hücrelerin aksine, NFI proteinleri kök hücrelerin çoğalmadan sessiz kalmasını ve hayatta kalmasını teşvik etmektedir. NFI'ların astrosit oluşumunda önemli olduğu ve gliogenezi tetiklediği, bununla birlikte kök hücre yenilenmesini aktifleştiren genlerin (EZH2, SOX9, HES1) ifadesini baskıladığı görülmüştür. Omurilik gelişiminde, NFI proteinleri erken nörogenezde farklılaşmayı engelleyerek nöral prekürsör hücre sayısının artmasını sağlarken, geç nörogenez süresince astrosit oluşumu ile ilişkili genlerkontrol ederek gliogenez oluşumunu teşvik etmektedir. Buna ek olarak, NFI'lar ile oligodendrosit oluşumu ile ilgili olduğu bilinen OLIG2 transkripsiyon faktörünün ifadelerinin birbirini negatif olaraketkiledikleri görülmüştür. Bu nedenle NFI proteinleri oligodendrit ve astrosit oluşumu arasındaki dengeyi sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarımızda, NFIA, NFIB ve NFIX proteinlerinin üçünün de arka beyindeki preserebellar sistemde ifade edildiği ve bu proteinlerden sadece NFIB ifadesinin yokluğunda preserebellar çekirdek nöronlarının gelişiminde azalma ve gecikme görülmüştür. Bu sebeple NFIB'nin arka beyin gelişimindeki rolünün nörogenez ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Ön araştırmalarda, NFIB ifadesinin yokluğunda mRNA ekspresyon analizi yapılarak preserebellar nöroprojenitörlerde NFIB'nin 33 adet hedef genleri tespit edilmiştir. Bu hedef genlerin içerisinden merkezi sinir sistemindeki fonksiyonları ve ekspresyonları sebebiyle iki hedef geni (CDO, FGF19) öncelikli olarak seçilmiştir. Nörogenezde temel bir rolünün olduğu düşünülen CDO hücre membran proteinidir ve merkezi sinir sisteminde ventriküler bölgelerde ifade edilir. CDO'nun beyin korteksinde sinyal kompleksi kurarak, bazik heliks-loop-heliks (Neurogenin-1) ve E protein (E47) heterodimerlerinin oluşumuna yol açıp, nöronal farklılaşmayı teşvik etmektedir. FGF19 ise büyüme faktörü ailesinin üyelerinden olup farede ifade edilen FGF15'in insanda ifade edilen formudur. FGF15'in beyin korteks gelişimi sırasında hücre çoğalmasını baskılayarak nöronal farklılaşmayı tetiklediği ve hücre döngüsünü kısalttığı görülmüştür. Bu çalışmada NFI'ların hedef gen olarak belirlenen CDO ve FGF19 promotörlerine bağlanıp bağlanmadığını araştırdık. Öncelikle her iki promoter için de ilk 5 kb'lik kısmını FIMO programı ile tarayıp CDO için 7, FGF19 için 8 bağlanma bölgesi elde ettik. Her iki gen için de düşük p value'e sahip olan ilk beş bölgeyi seçip türler arası homolojisine baktık.Öncelikle CDO geni için HEK293T hücrelerinde eksojen NFIB ile çalıştık, seçtiğimiz tüm bölgelere bağlandığını belirledikten sonra spesifik olmayan bağlanmalar belirlemiş olabileceğimiz için deneyi farklı epitopa sahip eksojen NFIB protein ile tekrarladık. 2. (IgG kontrole gore 6 kat fazla bağlanma görüldü)ve 3. bölgelerde, transkripsiyon başlama bölgesine yakın bölgeler, bağlanma görülürdü.ChIP deneyi daha sonra nöral projenitör hücrelerde yapıldı, NFI'ın daha önce de bağlandığını gördüğümüzpromotörün ilk 1 kb'lik alanda bulunan 2. ve 3. bölgeler ile tutarlı olarak etkileştiği belirlendi. Ardından projenitör ve farklılaştırılmış hücrelerdeki bağlanmayı karşılaştırmak için her iki hücre ile ChIP analizi yapıldı, hücreler arasında bağlanma sinyali açısından büyük bir farklılık görünmese de etkileşim olan bölgeler önceki çalışmalar ile tutarlı oldu. Nöral kök hücrelerde en çok ifade edilen aile üyesi NFIB iken, önceki çalışmalarda NFIB ekspresyonununfarklılaşmaya bağlı olarak azaldığı belirlenmiştir, Bu yüzden beklenilenin aksine ChIP analizinde projenitörlerde bağlanma sinyali daha az elde edildi, fakat bu durum, DNA'da aynı dizilere bağlanan NFI aile üyelerinden bazılarının, özellikle NFIA, ekspresyonunun farklılaşmaya bağlı olarak artması ile açıklanabilir. İkinci hedef gen olarak belirlenen FGF19 ile hNSC hücrelerinde yapılan ChIP analizinde ise transkripsiyon başlama bölgesi'ne en yakın bölgede tutarlı alarak bağlanma görüldü. HEK293T hücrelerinde ifade artımı ve hNSC hücrelerinde endojen NFI ile yapılan ChIP analizlerinden tutarlı sonuçlar aldıktan sonra, hNSC hücrelerinde ifade arttırımı çalışması yapıldı ve her iki gen için de belirlenen bağlanma bölgelerine bakıldı. Ön çalışma sonuçlarına göre, daha önce NFI'ların etkileştiği bölgelere ek olarak birer bölgeye daha bağlanma görüldü. NFIB CDO promotörü üzerinde daha once belirlenmiş 2. ve 3. bölgeye ek olarak 5. bağlanma bölgesi ile de etkileşti. Aynı şekilde FGF19 promotörü için 5. bölgenin dışında 1. bağlanma bölgesi ile de etkileşti. İlginç olarak bu bölgelerde ilk 1 kb'lik alan içinde bulunmaktadır. Ön çalışmadan elde edilen sonuçları doğrulayıp, lusiferaz raportör çalışması ile NFI'ların bağlanmalarının fonksiyonel olup olmadığına bakıyoruz.
Nuclear factor one (NFI) family of transcription factors play important roles in regulation of gene expression during nervous system development. NFI family has four members: NFIA, NFIB, NFIC and NFIX. NFIs bind to the consensus sequence, TTGGC(N5)GCCAA on double-stranded DNA as homodimers or heterodimers. NFI family members contain an N-terminal DNA binding and dimerization domain and a C-terminal transcriptional activation and repression domain. The N-terminal domain is highly conserved among members and includes an MH1 motif, also found in SMAD proteins of the TGF-β signalling pathway. The proline rich C-terminal domain is less conserved compared to the N-terminal domain. Each NFI member has multiple alternative splicing isoforms; however, functions of these isoforms of NFIs have not been well described. NFIA, NFIB and NFIX are all expressed in the central nervous system and are required for neural development. NFIA, NFIB and NFIX knock-out mice exhibit distinct phenotypes, where different developmental processes such as differentiation, neurogenesis or gliogenesis, are affected. Previously, we found that among the three neural NFI family members, NFIB is specifically required for development of the precerebellar neurons in the mouse hindbrain. As the defect in precerebellar development appeared to be due to a delay in neurogenesis, we looked for changes in gene expression of precerebellar neuroprogenitors by mRNA profiling. Of the 33 genes that were misregulated in NFIB-/- progenitors, CDO and FGF19 were initially selected for further study. Both genes are also implicated in regulation of neurogenesis. CDO is a cell surface glycoprotein of the Ig superfamily, is found in a signalling complex with BOC and N-cadherin and can trigger gene expression changes required for myogenesis and neurogenesis by enhancing heterodimerization of basic helix loop helix transcription factors with E proteins. FGF19 belongs to the fibroblast growth factor (FGF) family; it promotes neurogenesis by controlling the expression of neurogenic and proneural genes in the cerebral cortex and midbrain. In order find out whether these genes are direct targets of NFIB, we performed Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiments that test whether NFIB indeed binds to regulatory regions of these genes in vitro. First, we identified potential NFI binding sites in the 5 kb promoter region using the previously reported NFI specific position weight matrix. Scanning this region with the Find Individual Motif Analysis (FIMO) algorithm discerned seven binding sites for CDO and eight sites for FGF19. We selected the highest scoring five putative NFI binding sites for further study. To optimize the ChIP protocol, experiments were initially performed on HEK293T cells that overexpress epitope tagged NFIB. Binding of exogenous protein to the NFI sites were determined using ChIP followed by PCR. We found that exogenous NFIB reproducibly bound to site 2 (at about 6-fold enrichment) and site3, which are located within the 1kb region proximal to the transcription start site (TSS). Analysis of NFI occupancy in human neural stem cells (hNSCs, Gibco) found that endogenous NFI binds to the same two sequences, with 2.5-4 fold enrichment in ChIP. We also started to examine NFI occupancy of the FGF19 promoter in hNSCs. Here, endogenous NFI was found to bind to site 5, the NFI motif most proximal to the TSS. Next, we overexpressed epitope tagged NFIB in hNSCs and analysed binding to the same promoter sequences. Interestingly, preliminary results indicate that exogenous NFIB can bind to one additional site on each promoter. Namely, overexpressed NFIB binds to sites 2, 3 and 5, found in the 1 kb promoter region of CDO. On the FGF19 promoter, site 1 in addition to site 5, was found to be occupied by exogenous NFIB. Both of these NFI sites are also located in the 1 kb upstream region of FGF19. We are in the process of verifying the preliminary data and exploring the functionality of NFI occupancy of these sites by loss and gain of function experiments in hNSCs as well as luciferase reporter assays that measure NFI's effects on promoter activity.