Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
398069		A linkage analysis and a genome-wide association study on familial multiple sclerosis / Ailesel multipl skleroz'da bağlantı analizi ve genom çapı ilişkilendirme çalışması Yazar:ELİF EVEREST Danışman: DOÇ. DR. EDA TAHİR TURANLI Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı Konu:Genetik = Genetics Dizin:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2015 103 s.
Multipl Skleroz (MS); merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen, immun-aracılı, nöroinflamatuvar, nörodejeneratif bir hastalıktır. MS, hem ak hem gri maddede demiyelinizasyon ile görülen multifokal lezyonlar, aksonal transeksiyon, nöronal dejenerasyon, gliyozis ve perivenüler inflamatuvar hücre infiltratı ile karakterize edilir. Bu patolojik özelliklerin otoreaktif lenfositlerin kan beyin bariyerinden geçerek miyelin gibi MSS bileşenlerinin yıkımına sebep olmaları sonucu ortaya çıktığı düşünülmektedir. Bu proseste T hücrelerinin ana rolü oynadığı düşünülmekle birlikte, naif CD4+ T yardımcı hücrelerinden farklılaşan Th1 ve Th17 hücrelerinin patogenezdeki rolleri önceki çalışmalarda gösterilmiştir. MS patolojisi; başta görsel, duyu, motor ve kognitif semptomlar olmak üzere geniş bir klinik tablo oluşturmaktadır. Hastalık, farklı klinik tipler olarak kendini göstermektedir. Temel olarak MS'in klinik belirtileri 20 ve 40 yaşları arasındaki genç yetişkinlerde yinelenen-düzelen MS (RRMS) formu olarak ortaya çıkmakla birlikte atak dönemleri arasında hastalarda tam ya da kısmi düzelmeler gözlenir. RRMS hastalarının birçoğu sonradan progresif MS formlarına dönüşmektedir. MS'in klinik spektrumu ayrıca presemptomatik fazlar içermektedir. Bunlardan biri olan klinik izole sendromda (KIS) hastalar tek bir atak geçirir ve ikinci bir atak ya da spesifik lezyon aktivitesi gösterdikleri takdirde klinik olarak kesin MS teşhisi konur. MS tanısı için Schumacher kriterleri başta olmak üzere Poser ve McDonald (2001, 2005 revizyonu, 2010 revizyonu) kriterleri geliştirilmiştir ve günümüzde tanıda kullanılan belli parametreler mevcuttur. Klinik muayenenin yanı sıra göz önünde bulundurulan parametreler; magnetik rezonans (MR) görüntüsünde MS-spesifik lezyonların ve beyin-omurilik sıvısında oligoklonal bantların varlığı ve tepkisel potansiyel ölçümleridir. Mevcut kriterler ile MS'in tanısı kolaylaştırılmış olsa da nöromiyelit optika (NMO) gibi MS'e benzerlik gösteren bir grup hastalığın mevcut olması kesin tanıyı zorlaştırabilmektedir. Aynı zamanda alt tipler arasındaki geçişlerin ya da hastaların tedavilere verecekleri tepkilerin tahmin edilebilmesinde de zorluklar yaşanmaktadır. Bu amaçla bir süredir hastaların vücut sıvılarında gerçekleştirilen proteomik analizlere yoğunlaşılmasıyla birlikte, henüz geliştirilmiş ve onaylanmış tanı kitleri bulunmamaktadır. Diğer taraftan, bu çalışmalar ile günümüze kadar birçok aday protein belirteci tanımlanmıştır. MS, spesifik çevresel etkenler altında genetik olarak yatkın bireylerde ortaya çıkan kompleks bir hastalıktır. Klasik genetik çalışmalar sonucu MS'in 25%-76% arasında değişen kalıtılabilirlik hesaplamalarıyla birlikte genetik bir altyapısının olduğu gösterilmiştir. MS hastalarının birinci dereceden akrabası olmanın MS riskini 20-40 kat, yaklaşık 1/1000'den 1/25-50'ye arttırdığı gösterilmiştir. Ayrıca ikiz çalışmaları sonucu tek yumurta ikizlerinin MS için konkordans oranının çift yumurta ikizlerine göre daha fazla olduğu görülmüş, böylece gözlemlenen ailesel agregasyonun ortak çevredense ortak kalıtılan faktörlere daha çok bağlı olduğu ortaya çıkmıştır. MS'in genetik temelinin ilk kez kanıtlandığı bağlantı analizleriyle 6.kromozomda bulunan majör histokompatibilite kompleks (MHC) bölgesinin MS riski ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Daha sonraki bağlantı analizleriyle ayrıntılı haritalama sonucu spesifik olarak sınıf II insan lökosit antijen (HLA) bölgesindeki HLA-DRB1 lokusunun MS ile güçlü bir asosiyasyon gösterdiği bulunmuştur. Takip eden bağlantı ve aday-gen temelli analizler ile birçok farklı HLA asosiyasyonuna ek olarak interlökin 7 reseptör alfa (IL7RA) geninin de MS ile ilişkisi gösterilmiştir. Sonrasında gerçekleştirilen çip temelli genom çapı ilişkilendirme çalışmaları (GWAS) ile 110 tane HLA olmayan asosiyasyon bulunmuştur. Bu genlerin birçoğu T hücre aktivasyonu ve lenfosit proliferasyonu gibi immün yolaklarda yer aldığından, MS'in immün temelini destekleyecek niteliktedir. Ayrıca genlerin üçte birinden fazlasının daha önce farklı otoimmün hastalıklarla ilişkisi gösterilmiştir. Fakat, birçoğunun MS ile fonksiyonel olarak ilişkisi henüz bilinmemektedir. Ayrıca MS ile ilişkisi gösterilmiş bütün HLA olmayan genler düşük-orta risk etkisine sahip yaygın varyantları teşkil etmektedir ve HLA asosiyasyonları ile birlikte MS'in tahmin edilen kalıtılabilirliğinin yalnızca 27%'si kadarını açıklamaktadır. Daha yüksek işlem hacmine sahip teknolojilerin geliştirilmesiyle, mevcut verilerin meta-analizleriyle ve disiplinler arası çalışmalarla MS genetiği ile ilgili bu büyük bilgi açığının ilerleyen zamanlarda doldurulması mümkündür. Daha önce grubumuz, 2007'den beri İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Nöroloji Bölümü'nde toplanan farkli alt tiplere sahip 179 MS hastasında ve 42 MS olmayan kontrolde proteomik bir çalışma gerçekleştirmiş ve toplamda 151 proteinin kontrollerle karşılaştırıldığında MS hastalarında ya da farklı MS alt tiplerinde ekspresyon seviyesinin değiştiğini saptamıştır. Çalışmada birçok potansiyel biyobelirteçle birlikte MS'teki patolojik yolaklar açığa çıkarılmıştır. Bu yolaklar renin-anjiyotensin, aldosteron-regüle sodyum geri emilim, komplement-koagülasyon ve notch sinyal yolaklarını içermektedir. Bu çalışmada ise, bildiğimiz kadarıyla şu ana kadar ilk kez, ailesel MS soyağaçlarından ve akraba olmayan hasta/kontrol gruplarından elde edilen genetik veriler, aynı bireylerin proteomik sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Bu amaç ışığında, öncelikle MS hastalarını ve sağlıklı/hasta akrabalarını içeren 28 aileden (42 MS hastası, 37 sağlıklı kontrol) etik kurul onayı ve her bir bireyden bilgilendirme onam formu alındıktan sonra kan örneği toplanmıştır. Kan örneklerinden DNA izole edildikten sonra bilgi verici nitelikteki 10 aile seçilerek bir bağlantı analizi gerçekleştirilmiştir. Öncelikle bu ailelerdeki 18 MS hastası ve 17 sağlıklı akrabada Illumina CytoSNP 300K array kullanılarak genom boyu SNP genotiplemesi yapılmıştır. Toplamda 300.000 SNP genotiplendirilmiş ve eleme kriterlerinin ardından 245.008 adet SNP çalışmalara dahil edilmiştir. Bağlantı analizi için 1 cM aralıklarla bulunan 3118 bilgi verici SNP, SimWalk multipoint nonparametric linkage (NPL) analiziyle taranmıştır. Genomda NPL skoru 1.7'den yüksek olan 13. (37.9 cM, en yakın SNP rs612701, NPL Z = 1.72, p = 0.019) ve 21. (41.82 cM, en yakın SNP rs2834861, NPL Z = 1.7, p = 0.019) kromozomlardaki birer bölge detaylı haritalama amacıyla sırasıyla 639 ve 831 SNP ile 0.2 cM aralıklarla taranmıştır. Bunun sonucunda, bağlantı için en umut verici lokusların sırasıyla 1.82 ve 1.85 NPL skorlarıyla 13q13.3 (34.11 cM, en yakın SNP rs1461965, NPL Z = 1.82, p = 0.015) ve 21q22.2 (45.08 cM, en yakın SNP rs11701543, NPL Z = 1.85, p = 0.014) olduğu belirlenmiştir. Bu lokuslardan Interferon (Alfa, Beta, and Omega) Receptor 1 (IFNAR1) 18417, Interferon (Alfa, Beta, and Omega) Receptor 2 IFNAR2 11876 polymorphisms ve Mab-21-Like 1 (MAB21L1) CAG tekrar sayıları sonraki analizler için aday olarak seçilmiştir. Seçilen bölgeler Türk kökenli 27 akraba olmayan MS hastası ve 10 sağlıklı kontrolde polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılıp genotiplenmiştir. Genotip ve alel frekanslarının hesaplanarak istatistiksel analizler yapılmış ve bunun sonucunda IFNAR2 11876 GG genotipinin MS riskiyle ilişkisi bulunmuştur (P = 0.027, OR 3.64 [95% CI 1.09 – 12.1]). Daha sonra, proteomik çalışmaya ve bağlantı analizine dahil edilmiş olan 11 akraba olmayan MS hastası ve 60 sağlıklı kontrol ile bir genom çapı ilişkilendirme çalışması (GWAS) gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın sonucunda MS ile anlamlı derecede (P < 10-4) ilişki gösteren 14, anlamlıya yakın (P < 10-3) ilişki gösteren ise 106 SNP belirlenmiştir. Ardından, bağlantı analizi sonucu açığa çıkarılan kromozomal bölgeler ve GWAS sonucu bulunan SNP'ler analiz edilerek önceki proteom çalışması ile olası korelasyonlar incelenmiştir. GWAS sonucu MS ile anlamlı ölçüde ilişkili bulunan bir gen (INS-IGF2, P = 4.39E-07) ve anlamlıya yakın ölçüde ilişki gösteren sekiz genin (PRKCE, MAPK9, RBPJL, ADAMTSL1, NR6A1, NOTCH2, IL1R1, NTN1) MS alt tiplerinde etkilenmiş olduğu belirlenen yolaklarda rol aldığı gözlenmiştir. Ek olarak, GWAS ve bağlantı analizi için ortak olan üç gen (CLDN14, RUNX1, LINC00598) olduğu görülmüştür. Genetik analizlerde yer alan bireylerin tek tek proteom verisi incelendiğinde ise bir ya da daha fazla hastada ekspresyon seviyesi değişmiş 20 proteini kodlayan genin, GWAS sonucunda anlamlı ya da anlamlıya yakın ilişki gösteren SNP'i içerdiği belirlenmiştir. Bu genler arasından tek anlamlı SNP ilişkisi gösteren genin CNTN5 olduğu görülmüştür (P = 4.71E-05 and P = 7.79E-05). Bu çalışmada disiplinler arası bir yaklaşım izleyerek genetik, proteomik ve biyoinformatik analizler ile birçok aday gen belirlemiş bulunmaktayız. Bu genlerin MS'teki rolleri ileriki çalışmalarda araştırılacaktır.
Multiple Sclerosis (MS) is an immune-mediated, neuroinflammatory and neurodegenerative disorder affecting the central nervous system (CNS), and characterised by multifocal lesions in white and grey matter with demyelination, axonal transection, neuronal degeneration, gliosis, and perivenular inflammatory cell infiltrates. MS is a complex disease, which develops in genetically susceptible individuals under specific environmental influences. Early observations from classical genetic studies have shown that MS has a genetic background with a broad range of heritability estimates (25%-76%) reported by different studies. Early linkage analyses revealed a strong association of HLA-DRB1 locus of the class II human leukocyte antigen (HLA) region with MS. Subsequent linkage and candidate-gene based analyses have identified different HLA allele associations and a non-HLA association, interleukin 7 receptor alpha (IL7RA) gene. Further chip-based genome wide association studies (GWAS) have identified a total of 110 non-HLA associations, most of which are related to immune pathways, supporting the immune basis of MS. However, current knowledge on MS genetics can explain only about 27% of the predicted MS heritability, leaving much to be explored. We have previously conducted a proteome study in our MS cohort that have been collected in Istanbul University, Cerrahpaşa Faculty of Medical, Neurology Department since 2007. The proteome study identified pathological pathways in MS including renin-angiotensin, aldestorene-regulated sodium reabsorption, complement-coagulation and notch signalling patways with potential biomarkers. In the current study, to our knowledge for the first time, we wanted to correlate genomic data from familial MS pedigrees and unrelated patient/control groups with the proteome data. To this end, first we conducted a linkage analysis in MS patients and their affected and unaffected relatives. 10 multiplex MS families with 35 individuals were included in the analysis and SNP genotyping on the Illumina CytoSNP 300K array was performed for genomes of each individual. NPL scores were calculated for each of 3118 informative SNP markers spaced at an average of 1 cM intervals using SimWalk multipoint NPL analysis. Fine mapping of regions showing NPL scores higher than 1.7 was performed for each SNP markers spaced at every 0.2 cM, revealing that the most promising loci for linkage were mapped to 13q13.3 and 21q22.2, with NPL scores of 1.82 and 1.85, respectively. From the resulted loci, Interferon (Alpha, Beta, and Omega) Receptor 1 (IFNAR1) 18417, Interferon (Alpha, Beta, and Omega) Receptor 2 IFNAR2 11876 polymorphisms, and Mab-21- Like 1 (MAB21L1) CAG repeat number were selected as candidate genes for further analyses. Selected regions were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and genotyped in 27 unrelated patients with MS and 10 healthy controls of Turkish origin. Statistical analyses were performed to calculate genotype and allele frequencies, revealing a significant association of IFNAR2 11876 GG genotype with increased risk of MS (P = 0.027, OR 3.64 [95% CI 1.09 – 12.1]). We further conducted a GWAS comprising of 11 unrelated MS cases that had been included in the proteomic analyses and in the linkage study, and 60 healthy controls of Turkish origin, revealing 14 SNPs with significant association (P < 10-4), and 106 SNPs showing suggestive association with MS (P < 10-3). Subsequently, chromosomal regions from the linkage analysis and SNPs from the GWAS were analysed in order to observe a correlation with the previous proteomic findings. One gene with significant (INS-IGF2, P = 4.39E-07), and eight genes with suggestive associations (PRKCE, MAPK9, RBPJL, ADAMTSL1, NR6A1, NOTCH2, IL1R1, NTN1) from the GWAS were found to involve in pathways those shown to be affected in MS subtypes, and there were three genes common between the GWAS and linkage results (CLDN14, RUNX1, LINC00598). When individual proteome data of each patient involved in the genetic analyses was observed, a total of 20 proteins having altered expression level in one or more patients were also found to have significant or suggestive association in the GWAS. Among them, CNTN5 had the only significantly associated SNP markers (P = 4.71E-05 and P = 7.79E-05). Using a multi-disciplinary approach that combined genetic, proteomic, and bioinformatic analyses, we identified several candidate genes, whose possible roles will be explored in our further studies.