Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
405060		MEFV mutation analysis in familial Mediterranean fever, gout and adult-onset still's diseases / Ailesel Akdeniz ateşi, gut ve erişkin still hastalarında MEFV mutasyon analizi Yazar:SIMHA GILA BENYAKAR Danışman: DOÇ. DR. EDA TAHİR TURANLI Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı Konu:Genetik = Genetics Dizin:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2015 105 s.
Otoenflamatuvar terimi ilk olarak 1999 yılında kalıtsal periyodik ateş sendromları çalışan araştırmacı grup tarafından ortaya atılmış ve geliştirilmiştir. Sendromların asıl nedeninin doğal bağışıklık sisteminde görevli genlerde meydana gelen mutasyon/varyasyonlar ve değişen sinyal ve sitokin aktivasyon yolakları olduğu öne sürülmektedir. Ailevi Akdeniz ateşi (AAA, OMIM ID: 249100 ve 134610) otozomal resesif olarak kalıtılan, tekrarlayan ateş atakları, karın ve eklem ağrıları ile kendini gösteren, hastalığın daha ileri seyrinde amiloidoz görülebilen yaygın ve en iyi karakterize edilmiş otoenflamatuvar bir hastalıktır. Gut, ürik asit kristallerinin dokularda ve sıvılarda birikmesi ile oluşan, genellikle 40 yaşı aşmış erkek bireylerde görülen ve metabolik, kardiyovasküler ve böbrek yetmezliği ile sonuçlanabilen, eklem bölgelerinde ödem, kızarıklık ve şiddetli ağrı ile kendini gösteren enflamatuvar bir hastalıktır. Erişkin Still hastalığı (ESH) ise nadir enflamatuvar hastalık olup etiyolojisi bilinmemektedir. MEFV, MEditerranean FeVer geni, tanımlanan ilk otoenflamatuvar gen olup, AAA ile ilişkilendirilmiştir. Günümüzde MEFV geninde tanımlanmış olan 305 sekans varyansları mevcuttur. Yeni mutasyon/varyasyonlar ve AAA ile ilişkileri halen çalışılmaktadır. MEFV geni MEFV geni 10 ekzondan oluşmakta olup, mutasyon/varyasyonlar genin 1, 2, 3, 5, 9 ve 10. ekzon bölgelerinde bulunmaktadır. Mutasyon/varyasyonların çoğu yanlış anlamlı olup, 2. ve 10. Ekzon bölgeleri çevresinde yer almaktadır. En sık görülen mutasyon/varyasyonlar, 10. ekzonda yer alan V726A, M694V, M694I, M680I ve 2. Ekzonda yer alan E148Q, hastalıkla ilişkili allellerin yaklaşık %70'ini oluşturmaktadır. MEFV geninin ürünü olan Pyrin/Marenostrin (P/M) proteini, 781 aminoasitten oluşmakta ve başlıca granülosit, monosit, dendritik hücre ve eklem sıvısında bulunan fibroblast hücrelerinde anlatımı yapılmaktadır. Proteinin her alt birimi farklı proteinlerle etkileşime girerek hücre ölümü, sitokin salınımı, transkripsiyonun düzenlenmesi gibi farklı fonksiyonlar göstermekte, ancak asıl görevi enflamasyonun regülasyonu olduğu açıklanmaktadır. MEFV genindeki mutasyon/varyasyonların hastalıkla ilişkili olduğu ve klinik tabloyu etkilediği gösterilmektedir. AAA hastası olmasına rağmen, MEFV mutasyon/varyasyonları taşımayan bireylerin olması, hastalığın genetiğinin daha kompleks olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca P/M rolü tam olarak açıklanmamıştır. Bu çalışmada MEFV geninin AAA'ya ve ya genel enflamatuvar yolağına spesifikliğinin diğer otoenflamatuvar hastalıklarla karşılaştırılarak araştırılması amaçlanmıştır. MEFV geninin ikinci ve onuncu ekzon bölgelerindeki mutasyon/varyasyon frekansları AAA (N=75), Gut (N=30) ve ESH (N=28) hastalarında ve sağlıklı kontrol grubunda (N=54) karşılaştırılmıştır. Çalışmanın ikinci kısmında ise, P/M protein seviyeleri AAA (N=22) ve sağlıklı kontrollerde (N=9) araştırılmıştır. DNA ve protein örnekleri tüm kandan elde edilmiştir. İlk olarak tüm mutasyon/varyasyon frekansları gruplar arası karşılaştırılmıştır. MEFV gen mutasyon/varyasyonları AAA grubunda 73 (97.3%), ESH grubunda 21 (75%), Gut grubunda 20 (66.6%) ve sağlıklı kontrollerde 35 (64.8%) kişide bulunmuştur. AAA grubu alellerinin %16.2'si, Gut grubunun %6.8'i, ESH grubunun %5.4'ü ve sağlıklı kontrollerin %7'si mutasyon/varyasyon taşıyan alelleri kapsamaktadır. Hasta grupları ile sağlıklı kontrol grubu arasındaki MEFV mutasyon/varyasyon frekans farkı istatistiksel olarak anlamlıdır (p=<0.0001). A165A-D102D-G138G ortak haplotipi tüm gruplarda gözlemlenmiş olup, AAA grubunda diğer gruplara göre, Gut (30%), ESH (22.6%) ve sağlıklı kontrol (33.6%), daha yüksek frekansta gözlenmiştir (%61.8) (istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamaktadır). Yaygın varyasyonlardan ikinci ekzon üzerinde bulunan E148Q gruplar arasında yaklaşık olarak aynı frekansta gözlenmiştir. Alel frekansları sırasıyla %5.3, %5.0, %7.1, %5.6 olarak AAA, Gut ESH hastaları ve sağlıklı kontrollerde görülmüştür (istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamaktadır). İkinci ekzonda sadece R202Q varyasyonu AAA hastalarında daha sık (%42), diğer gruplarda ise %19-25 oranında görülmüştür (FH: p<0.0001, FG: p=0.0266, FS: p=0.0032). AAA grubu alellerinin %16.2'sinde mutasyon/varyasyon görülmüş olup, bunların %2.2'si R202Q, %0.3'ü ise E148Q'dur. Patojenik mutasyon/varyasyonların AAA grubunda diğer gruplarla arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu bulunmuştur. Tüm alellerinin %5.2'sinde mutasyon/varyasyon görülmüş olup, bunların %3.5'i AAA grubuna, diğerleri ise %0.5-0.6 oranında diğer gruplarda görülmüştür. Patojenik mutasyon/varyasyonlar tüm gruplardaki alellerin %19.7'sini oluştururken, sadece E148Q (%4.6) ve M694V (%11.2) tüm gruplarda ortak olarak görülmüştür. En yaygın mutasyon/varyasyon M694V olarak bulunmuş olup, AAA grubunun %8.9'unu, Gut grubunun %1.3'ünü, ESH grubunun %0.4'ünü ve sağlıklı kontrollerin %0.6'sini oluşturmaktadır (p=<0.0001). Gut ve ESH hastalarında artan M694V alel frekanslarının daha detaylı olarak araştırılması gerekmektedir. Çalışmanın ikinci kısmında, AAA hastalarında (N=22) P/M protein seviyeleri sağlıklı kontrol ile (N=9) karşılaştırılarak incelenmiştir. AAA hastaları ve sağlıklı kontrollerde P/M protein seviyelerine bakıldığında, iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamasına karşın, AAA hastalarında protein seviyelerinin sağlıklılara göre yaklaşık iki kat az olduğu gözlenmiştir (p=0.3920). Öncül çalışmamızın sonuçları literatürde yer alan önceki çalışmalara göre zıt bir durum ortaya çıkarmaktadır. Mutasyon/varyasyonlar ile P/M seviyesi arasında olası ilişkiyi araştırmak üzere MEFV mutasyon/varyasyon analizi protein çalışması grubundaki bireylere de yapılmıştır. M694V alel frekansı AAA grubunda %34.1 iken sağlıklılarda %5.6 olarak gözlenmiştir (p= 0.0247). Her iki grupta da gözlenen diğer mutasyon/varyasyonlar E148Q, R202Q ve R761H olmasına karşın, istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmemiştir. M694V taşıyan AAA hastalarında ortalama P/M seviyesi 0.23 iken, taşımayan hastalarda ortalama 0.33 olarak gözlenmiştir. Hasta grubunda bir kişiden ataklı döneminde örnek alınmıştır. Bu birey M694V mutasyon/varyasyonu taşımamasına karşın, grupta en yüksek P/M seviyesine sahip bireydir. Ataklı hastada ataklı olmayan diğer hastalara göre daha yüksek P/M seviyesi ve toplam mutasyon/varyasyon taşıyan alel sayısı olduğu gözlenmiştir. Protein çalışmasında istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için deneyler daha fazla örnek sayısı ile tekrarlanarak optimize edilmelidir.
The "autoinflammatory" term is first defined and developed in 1999 by a group of researcher who were studying hereditary periodic fever syndromes. The main cause of the syndromes is mutations/variations in genes involved in innate immunity and their alteration of the signaling or cytokine activation pathways. Familial Mediterranean fever (FMF, OMIM ID: 249100 and 134610) is one of the most common and best characterized inflammatory diseases that is inherited autosomal recessively and characterized by recurrent attacks of fever, abdominal pain, rashes, and arthritis while amyloidosis is the most severe complication of the autoinflammatory disorder. Gout is common inflammatory arthritis caused by hyperuricemia and the deposition of uric acid crystals in tissues and fluids within the body which results with metabolic, cardiovascular and renal morbidity especially in men over age of 40. Adult-Onset Still's Disease (AOSD) is a rare inflammatory disorder of unknown etiology and characterized by daily spiking fever, arthritis and rash. MEFV, MEditerranean FeVer gene is the first autoinflammatory gene that is introduced as a candidate gene for FMF. To date, 305 sequence variations are identified on MEFV gene. Still new mutations/variations and their association with FMF are understudied. Mutations/variations are located in exons 1, 2, 3, 5, 9 and 10 of MEFV. The majority of the mutations/variations are missense changes and clustering in exons 2 and 10. There are five common mutations/variations; V726A, M694V, M694I, M680I in exons 10 and E148Q in exon 2. MEFV transcripts encode a 781 amino acids protein called Pyrin or Marenostrin (P/M). The main function of P/M protein is the regulation of caspase-1 activation, relatively interleukin-1β (IL-1β) production. The association between FMF and MEFV gene mutations/variations is well established in the previous studies, still the existence of patients without mutations/variations and P/M role were not clarified. The aim of this study was to examine the specificity of MEFV gene to FMF or to general inflammatory pathway by comparing with other autoinflammatory diseases. MEFV exon 2 and 10 variations were explored in a group of FMF (N=75), Gout (N=30) and AOSD (N=28) patients and compared the frequencies between disease groups and healthy controls (N=54). MEFV gene product P/M is indicated to have a role in inflammatory pathway. The aim of the protein studies was the quantification of P/M levels in FMF (N=22) patients compared to healthy controls (N=9). DNA and protein samples were obtained from whole blood. We first compared all mutations/variations between the patient and HC groups. MEFV gene mutations/variations were detected in 73 (97.3%) patients in FMF group, 21 (75%) in AOSD, 20 (66.6%) in Gout and 35 (64.8%) in HC group. MEFV mutations/variations were detected in 16.2% of alleles in FMF, 6.8% in Gout, 5.4% in AOSD patients and 7% in HC. The difference in the frequency of the MEFV mutations/variations between the patient groups and control group was statistically significant (p=<0.0001). The common haplotype A165A-D102D-G138G was observed frequently in all groups, but the frequency was higher in FMF group (61.8%) compared to Gout (30%), AOSD (22.6%) and HC (33.6%) (non-significant). One of the most common variations E148Q in exon 2 was observed at a frequency quite similarly between groups. The frequencies were 5.3%, 5.0%, 7.1%, 5.6% in FMF, AOSD, Gout patients and healthy controls, respectively (non-significant). In exon 2, only R202Q variation was found to be more frequent in FMF patients (42%) compared to other groups (19-25%) (FH: p<0.0001, FG: p=0.0266, FS: p=0.0032). Out of 16.2% of all observed mutations/variations in FMF, R202Q was observed in 2.2%, whereas E148Q in 0.3%. There was also significant difference in pathogenic mutations/variations between FMF and other groups. Out of 5.2% of all alleles, they were observed 3.5% in FMF, whereas 0,5-0,6% in other groups. Within these pathogenic mutations/variations, out of 19.7%, only E148Q (4.6%) and M694V (11.2%) were observed in all groups. The most prominent pathogenic mutation/variation was M694V. It was observed 8.9% in FMF, 1.3% in Gout, 0.4% in AOSD and 0.6% in healthy controls as being the most frequent mutations/variations (p=<0.0001). As a further aspect, increased M694V frequency in Gout and AOSD patients compared to HC requires further analysis. Second part of this study, we wanted to investigate the quantification of P/M levels in FMF (N=22) patients compared to healthy controls (N=9). Our preliminary results indicate approximately two fold decrease of P/M levels in FMF patients compared to HC group (p=0.3920), which is the opposite of the previous results. To investigate the relationship between mutations/variations and P/M levels, MEFV mutation/variation analysis were also performed in protein study group. The allele frequencies of M694V in FMF and HC were 34.1% and 5.6%, respectively (p=0.0247). E148Q, R202Q and R761H were also observed in both groups, however NS. The average P/M quantity of the patients carrying M694V mutation/variation was 0.23, whereas non-carriers had 0.33. One of the FMF patients was in her/his attack period when the sample was collected and the P/M level was highest even though he/she was not M694V mutation/variation carrier. We have observed much higher P/M level and total mutation/variation carrying allele in attack patient compared to attack free patients. The protein study requires optimization with enlarged sample sizes and replicated for more accurate statistical results.