Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
393033		Investigation of molecular pathways and biomarkers in Multiple sclerosis clinical subtypes / Multipl skleroz klinik alt tiplerinde moleküler yolakların ve biyobelirteçlerin araştırılması Yazar:TİMUÇİN AVŞAR Danışman: DOÇ. DR. EDA TAHİR TURANLI Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology Dizin:Hücresel yolaklar = Cellular pathways ; Mikrodizilim analizi = Microarray analysis ; Multipl skleroz = Multiple sclerosis	Onaylandı Doktora İngilizce 2015 140 s.
Multipl skleroz (MS) merkezi sinir sisteminde (CNS) nöroenflamasyon ve nörodejenerasyon ile karakterize, otoimmün kökenli olduğu kabul edilen, enflamatuvar, demiyelinizan bir hastalıktır. MS patojenezinde dolaşım sisteminde oto reaktif hale gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin kan beyin duvarını (BBB) aşarak ya da CNS'de otoimmun hale gelen çeşitli hücrelerin nöronları çevreleyen myelin kılıfa saldırması görülmektedir. Nöronların ve daha ileri seviyelerde oligodendrosit hücrelerin yıkılması CNS'de farklı bölgelerde ve farklı zamanlarda lezyonların oluşmasına neden olmaktadır. Bu lezyonlarla ilişkili olarak gelişen demiyelinizasyon ve aksonal dejenerasyon MS'deki nörolojik engellilikten sorumlu olarak kabul edilmektedir. MS'in etiyolojisi tam olarak bilinmemekle birlikte genetik ve çevresel risk faktörlerinin etkileşimiyle kompleks kalıtım paterninde ortaya çıktığı en yaygın görüştür. Genç erişkinlerde nontravmatik nörolojik hastalıklar arasında özürlülüğe yol açan en önemli hastalıktır. Kronik, nöroenflamatuvar, nörodejeneratif bir hastalık olarak tanımlanan Multipl skleroz'un (MS), kompleks patojenezi ve farklı prognozları ile birlikte çeşitli klinik alt tipleri bulunmaktadır. Bu alt tipler hastalığın ilerleyişine ve semptomların ya da radyolojik bulguların ortaya çıkma sıklığına bağlı olarak farklı isimlerle sınıflandırılmaktadır. Klinik izole sendrom (CIS), yineleyici – düzelen MS (RRMS), birincil ilerleyen (PPMS) ve ikincil ilerleyen (SPMS) MS'in ana klinik alt tipleri olmakla birlikte MS'in farklı formlarına benzeyen fakat ortaya çıkışı ve diğer klinik parametrelere bağlı olarak farklı MS varyantları da bulunmaktadır. MS'in klinik alt tipleri arasında geçişler de görülebilmektedir. Farklı klinik alt tipleri, patojenezinde farklılıklar ve hastalığın kompleks yapısı göz önünde bulundurulduğunda, MS'in tanı ve prognozunun da ne kadar karmaşık olduğu görülmektedir. Bu nedenle hastalığın tanı ve prognozunda kullanılabilecek biyobelirteçlere ihtiyaç duyulmaktadır. Biyobelirteçler, normal biyolojik süreçleri, hastalık süreçlerini, veya ilaç yanıtlarının göstergeleri olarak, nesnel, objektif ölçülebilen ve değerlendirilebilen özellikleri taşıyan, bağımsız biyolojik moleküller ve görüntüleme simgeleri olarak tanımlanırlar. Biyobelirteçler ayrıca hastalıkların biyolojik mekanizmalarının çözümlenmesinde de önemli rol oynarlar. Özellikle MS gibi klinik ve genetik heterojenite gösteren kompleks hastalıklarda hastalığın klinik alt tiplerinin birbirinden ayırt edilmesinde, farklı ilaçlara verilebilecek cevapların önceden anlaşılabilmesinde ayırıcı biyobelirteçlere ihtiyaç vardır. Farklı alt tiplerle ilişkilifarklı biyobelirteçlerin yer aldığı moleküler yolakların ya da protein – protein ilişkilerinin ortaya çıkarılması da hastalığın moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına yardımcı olacağı gibi, tanı ve prognozun yanı sıra tedavi etkinliğinin de artırılabilmesine olanak sağlamaktadır. Bu çalışmada amaç MS alt tiplerine ait BOS örneklerinde, proteomik ve biyoinformatik yaklaşımlarla elde edilen protein biyobelirteçleri kullanılarak, farklı MS alt tiplerinin etiopatojenezinde rol alan moleküler yolakların ortaya konulmasıdır. Bu amaçla ilk olarak farklı klinik alt tiplerdeki aday protein biyobelirteçler, kontrol örnekleri ile yapılan kıyaslamalar ile ortaya konularak, proteilerin ifadelenme seviyeleri belirlenmiştir. Daha sonra, bu proteinler ve ifadelenme oranları kullanılarak PANOGA (Pathway and Network-Oriented GWAS Analysis) web ara yüzü ile KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) moleküler yolakları, biyoinformatik analizler ile belirlenmiştir. Bu yolaklarda yer alan diğer ilişkili proteinler belirlenerek hedef genler ve proteinler ortaya konulmuştur. Genom seviyesinde biyobelirteçlerin ortaya konulabilmesi için de ailesel MS olgularında genom boyu bağlantı (linkage) ve ilişkilendirme (association) çalışmalarında da hastalık ile ilişkili genetik varyantlar ve kromozom bölgelerinin belirlenmesi sağlanmıştır. Proteomik ve genomik verilerin karşılaştırılması ile elde korelasyon gösteren protein ve genlerin MS patojenezindeki rolleri göz önüne alınarak açığa çıkarılması hedeflenmiştir. Proteomik çalışmalarda 65 CIS, 72 RRMS, 42 ilerleyici MS (PMS) (PPMS ve SPMS birlikte) ve 42 kontrol örneğine (sağlıklı kontroller ve diğer nörolojik hastalıklara sahip hastalardan elde edilen örnekler) ait beyin omurilik sıvısı (BOS) ve serum kullanılarak her bir örnekten protein izolasyonu ve saflaştırılması yapıldı. 2D-PAGE (iki boyutlu jel elektroforezi) analizi ile en az 2 kat farklı miktarda ifadelendiği tespit edilen protein spotlarını belirlemek üzere farklı klinik alt tipler ve kontrollerle karşılaştırılmıştır. Tüm protein spotlarının kontrollerle karılaştırıldığında kat değişimleri belirlenerek listelenmiştir. Tüm protein spotları jellerden çıkarılarak kütle spektrometresi için hazır hale getirilmiştir. Matriks assited laser desorption ionization – time of flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) analizi yapılarak spotların ait olduğu peptit dizileri ve proteinlerin isimleri tanımlanmıştır. Genom boyu bağlantı ve asosiasyon çalışmaları için 28 farklı ailesel MS örnekleri toplanmıştır. Bu ailelerden bağlantı analizi için en uygun 10 aile seçilmiştir. Bu aileler MS tanısı almış 19 hasta ve 17 sağlıklı bireyden oluşmaktadır. Toplam olarak bu ailelerden 36 örneğe mikrodizin çalışması yapılmıştır. Aileler, birinci derece yakınlarında MS tanısı almış hastalar ve en az 1 sağlıklı birey içeren ailelerden oluşmaktadır. Mikrodizin çalışması için Illumina CytoSNP 300K SNP genotiplendirme çipleri kullanılmıştır. Elde edilen ham veriler hem bağlantı analizleri için hem de ilişkilendirme çalışmaları için kullanılmıştır. Aileler içerisinde de bağlantı analizi yapmak için, parametrik olmayan bağlantı (NPL) skoru, SimWalk multipoint NPL analizi ile 3118 belirteç üzerinde ve ortalama 1 cM aralıklarla incelenmiştir. Sonrasında ise, detaylı haritalama ile daha yüksek çözünürlükte analiz yapıldı ve NPL değeri 1.8 üzerinde olan kromozomal bölgeler elde edildi. GWAS analizi için ailele MS örneklerinde birbiri ile akraba olmayan 11 MS hastası belirlenerek ve yine birbiri ile akrabalık ilişkisi bulunmayan 60 sağlıklı bireyle karşılaştırma yapılmıştır. Sağlıklı bireylerin mikrodizin analizlerinde de aynı Illumina çipleri (300K) kullanılmıştır. Biyoinformatik analiz için Golden Helix® SNP & Variation Suite (SVS) programı kullanılmıştır. Yapılan analizlerde ilk olarak 298114 genom boyu SNP verisi farklı özelliklerine göre filtreleme işlemine tabi tutulmuştur. Kalite ve kantitatif filtrelemeler sonucunda 129547 SNP belirteçi hasta ve sağlıklılarda karşılaştırılmıştır. Proteomik çalışmalarda, MS klinik alt tipleri ve kontroller arasında yapılan karşılaştırmalarda kontrollere göre istatiksel olarak anlamlı miktarda farklılık gösteren 151 protein tespit edilmiştir. Bu proteinlerden literatürde daha önce MS ile ilişkilendirilmiş olanlar ve ilk kez tespit edilenler listelenmiştir. KEGG yolak analizi sonucunda da, farklı miktarlarda ifadelenen protein biyobelirteçleri kullanılarak, hastalık grupları arasında ortak ve alt gruplara özgü moleküler yolaklar ortaya çıkarılmıştır. Bunlardan renin-angiotensin system (RAS) ve complement and coagulation cascade (CCC) yolakları tüm MS alt gruplarında ortak olarak kontrol grubuna göre artmış bir aktivite göstermektedir (p<0.0001). İmmun hücre göçünde önemli bir yolak olan Aldosterone-regulated sodium reabsorption (p=8.02x10-5) yolağı, Th17-bağımlı immunite gelişiminde önemli renin-angiotensin (p=6.88x10-5), aktif remyelinizasyonda etkili notch-signaling (p=1.83x10-10) yolağı ve vitamin emiliminde görevli vitamin digestion and absorption (p=1.73x10-5) yolağı da klinik alt tipler arasında farklılıklar göstermiştir. Genomik çalışmalarda ise, 13q12.2-14.11 ve 21q22.12-22.3 kromozom bölgelerinde NPL skoru 1.8 ve üzeri bağlantı bölgeleri tespit edilmiştir. Detaylı haritalama ile de en yüksek bağlantı skorlarının 13q13.3 ve 21q22.2 bölgelerinde olduğu gösterilmiştir. Bu bölgelerde yer alan genlerin incelenmesi ile de hem MS ile daha önce ilişkilendirilmiş hem de ilişkilendirilmemiş inflamasyon ve nörodejenerasyon yolaklarında yer alan genler listelenmiştir. Ayrıca N4BP2L2 ve TRPC4 görevleri gereği MS ile daha detaylı incelenmesi gereken yeni aday potansiyeli olan genler tespit edilmiştir. GWAS çalışmalarında ise hastalık ile ilişkili SNP'ler listelenerek bu varyantların bulunduğu genler gösterilmiştir. Bu genlerin bir kısmının (INS - IGF2, p = 4.39x10-7 MAF = Case : Control = 0.36/0.03, MGMT, p = 9.66x10-6 MAF = Case : Control = 0.32/0.04) MS patojenezinde yer alan genler olduğu tespit edilmiştir. Proteomik ve genomik sonuçların, bireysel olarak tüm ailesel MS örneklerinde karşılaştırılması sonucunda, 4 farklı moleküler yolakta, 9 gen ve 14 proteinin korelasyonu gösterilmiştir. Bu genler ve proteinler hastalığın moleküler mekanizmasının anlamamız için en uygun moleküler parametreler olup, farklı diğer çalışmalarla doğrulanması gerekmektedir. Sonuç olarak bu çalışma ile farklı MS klinik alt tiplerinde etkili moleküler yolaklar belirlenmiştir. Hem klinik alt tiplerde ortak yolaklar hem de farklı yolaklar ortaya çıkarılmıştır. Ayrıca MS'de tuz metabolizmasının, hastalığın gelişiminde ve prognozundaki önemi ilk kez in vivo olarak ortaya konulmuştur. Elde ettiğimiz veriler, literatürdeki klinik ve hayvan modeli çalışmaları ile uyumluluk gösterirken, hedef moleküler yolakların hasta örneklerine ait BOS sıvılarındaki değişimleri ilk kez gösterilmiştir. Ayrıca faklı MS klinik alt tiplerine ait potansiyel protein biyobelirteçleri listelenerek hastalığın tanı ve prognozunda kullanılabilme potansiyelleri tartışılmıştır. Genomik sonuçlarla proteomik sonuçların karşılaştırılması ile hastalık patojenezinde önemli ve korelasyon gösteren aday genler ve proteinler ortaya konmuştur. Gelecek çalışmalarda ise aday genlerin ve proteinlerin hastalığın in vivo modellerinde ve klinik çalışmalarda doğrulama çalışmaları yapılması hedeflenmektedir.
Multiple sclerosis (MS) is a neuro-inflammatory and neuro-degenerative disease of the central nervous system (CNS), in which myelin sheaths and axons are damaged. Inflammatory demyelination and other pathological changes disrupt the ability of the nervous system to communicate resulting the wide variety of signs and symptoms. Heterogeneous clinical presentation and course ıf the disease, without an effective diagnostic laboratory test, make it difficult to draw firm conclusions about the disease's states, drug response and in general prognosis which may lead to more severe forms in some cases. The purpose of this study is to find out molecular biomarkers and pathways associated with the etiopathogenesis of the disease and its major subclinical forms. To this aim, proteomic, bioinformatics and genomic approaches were used to reveal differentially expressed proteins and their related pathways in cerebrospinal fluids of patients with clinically isolated syndrome (CIS), relapsing remitting MS (RRMS) and progressive MS (PPMS). Cerebrospinal fluid (CSF) samples of 65 CIS, 72 RRMS, 42 PPMS and 42 controls including healthy subjects and other neurological disease samples were analyzed. For all samples, 2D-PAGE analyses were performed. At least 2 times differently expressed protein spots were identified by PDQuest® software and removed from the gel for MALDI-TOF-MS protein identification analysis. The results of proteomic studies were further confirmed by both ELISA and western blot methods for selected candidate proteins. KEGG pathways analysis was performed with genes corresponding the proteins to identify disease relevant specific molecular pathways. Further linkage and genome-wide association study (GWAS) were performed by using single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping on the Illumina CytoSNP 300K array in 36 individuals from 10 informative MS families having more than one affected member. Nonparametric linkage (NPL) scores were calculated for each of 3118 SNP markers spaced at an average of 1 cM intervals using SimWalk multipoint NPL analysis. Subsequent fine mapping of regions showing higher NPL scores was performed. GWAS analysis was performed by using 18 MS and 60 healthy subjects data by comparing the 298114 different genome wide SNPs. Comparison of disease groups with controls identified a total of 151 proteins that are differentially expressed in clinically different MS subtypes. KEGG analysis using PANOGA tool revealed disease related pathways including aldosterone-regulated sodium reabsorption (p=8.02x10-5) which is important in the immune cell migration, renin-angiotensin (p=6.88x10-5) system that induces Th17 dependent immunity, notch signaling (p=1.83x10-10) pathway indicating the activated remyelination and vitamin digestion and absorption pathways (p=1.73x10-5). Linkage study including 10 MS families showed suggestive evidence of linkage (NPL scores above 1.7) to chromosomal regions of 13q12.2-14.11 and 21q22.12-22.3. Fine mapping of these regions revealed that the most promising loci for linkage were mapped to 13q13.3 and 21q22.2, with NPL scores of 1.82 and 1.85, respectively. Detailed search of these regions revealed inflammation and neurodegeneration associated genes some of which previously implicated in MS and also promising novel genes yet to be identified like N4BP2L2 and TRPC4 were found within the suggestive regions. On the other hand, GWAS analysis revealed disease associated SNPs with significant associations on disease pathogenesis associated genes like INS-IGF2 (p=4.39x10-7 MAF = Case:Control = 0.36/0.03), MGMT (p=9.66x10-6 MAF = Case:Control = 0.32/0.04). Individual comparison of genomic and proteomic data revealed 9 different genes correlated with 14 different proteins, in 4 different molecular pathways that are associated with proteomic data. Those genes and proteins are the most prominent molecular parameters to understand disease mechanisms and needed to be further verified with various studies. To conclude, proteomic investigation of CSF samples belonging to different MS phenotypes indicated that all MS clinical forms share common biological pathways such as renin-angiotensin system (RAS) and complement and coagulation cascade (CCC) pathways. There are also clinical subtypes specific and pathophysiology related pathways, which may have further therapeutic implications. Furthermore, our study implicated importance of salt metabolism in MS pathogenesis for the first time. On the other hand, genomic results also showed disease pathogenesis associated genetic variations and chromosomal regions. Our suggestive results provide a framework for deep sequencing to identify new susceptibility genes and novel variants associated with risk of MS.