Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
496434		Investigation of the possible effect of intragenic MEFV gene CpG island methylation on mRNA transcription and pyrin localization / MEFV geni intragenik CpG adacığı metilasyonunun mRNA transkripsiyonu ve pyrin lokalizasyonu üzerindeki olası etkisinin araştırılması Yazar:GÖKÇE ERDEM Danışman: PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı Konu:Genetik = Genetics Dizin:	Onaylandı Doktora İngilizce 2017 146 s.
Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA), genellikle akdeniz kökenli toplumlarda görülen, ateşli ataklarla seyreden bir enflamatuvar hastalıktır. Hastalığın en ağır komplikasyonu amiloidoz olup tedavi edilmezse ölümle sonuçlanabilir. Hastalığın tedavisinde genel olarak Kolşisin kullanılmakla beraber; Anakinra, Rilanosept, Etanersept, Infliksimab ve Tosilizumab gibi ilaçlar Kolşisin'e dirençli hastalarda kullanılmaktadır. MEditerranean FeVer (MEFV) geni, 1997 yılında Uluslararası ve Fransız AAA konsorsiyumları tarafından AAA'nın geni olarak tanımlanmıştır. Günümüze kadar 315 varyasyonu tanımlanan bu gendeki özellikle 5 varyasyonun ((c.2080 A>G, p.Met694Val; c.2082 G>A, pMet694Ile; c.2177 T>C, p.Val726Ala; c.2040 G>C, p.Met680Ile ve c.442 G>C, pGlu168Gln) hastalığa yol açtığı bildirilmiştir. Ancak AAA'nın çok sık görülmediği bölgelerdeki hastaların %5 ila 20'sinde hiçbir varyasyon gözlenmemektedir. Bu durum AAA'nın oluşmasında MEFV varyasyonlarının tek etken olmayabileceğini düşündürmektedir. MHC Class I Polypeptide-Related Sequence A (MICA) geni, MEFV ile epistatik etkileşime girebilecek modifikatör gen olarak önerilmiş, ancak anlamlı sonuçlara ulaşılmamıştır. Bu bağlamda, varyasyonlar dışında MEFV expresyonunda düzensizliklere yol açacak değişikliklerin, hastalığın gelişiminde rol oynayabileceği düşünülmüştür. MEFV genellikle beyaz kan hücrelerinde eksprese olmakla birlikte, kendisinin sinovyal fibroblast ve dentritik hücrelerde de ekprese olduğu bilinmektedir. Yapılan çalışmalar sonucunda AAA hastalarının MEFV ekpresyonunun sağlıklı kontrollere oranla daha az olduğu ve atak dönemlerinde bu ekspresyonun daha da azaldığı görülmüş, bu azalmanın enflamasyona bağlı olduğu öne sürülmüştür. Grubumuzun önceki yıllarda yürüttüğü, AAA hastaları (S=51) ve sağlıklı kontrollerin (S=11) kan örneklerinden izole edilen lökositlerdeki MEFV ekspresyonu çalışmasında benzer sonuçlar elde edilmiş, hastalardaki ekspresyon sağlıklı kontrollere orana daha düşük bulunmuştur (p=0.031). Ancak AAA hastaları ve sağlıklı kontrollerin periferal kan mononükleer hücrelerindeki (PBMCs) MEFV ekspresyonunu araştıran diğer bir çalışmada, hastalardaki MEFV espresyonunun daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Ekpresyonu etkileyebilecek mekanizmalardan biri de epigenetik mekanizmalardır. Bu mekanizmalar DNA metilasyonu, histon modifikasyonları ve kodlamayan RNA'ları içermekle beraber en sık rastlanan epigenetik mekanizma DNA metilasyonudur. DNA metilasyonunun en sık görüldüğü bölgeler gen promotörleridir. Ancak promotör dışındaki bölgelerdeki (intron ve ekzon) metilasyonun da transkripsiyonu etkilediği bilinmektedir. MEFV geminin ikinci ekzonunun tamamını kapsayan, 998 bp uzunluğunda bir CpG adacığı vardır (NC_000016.10, 3254057 – 3255054). Bu adacıktaki metilasyonun MEFV ekspresyonunu etkileyebileceği düşüncesiyle AAA hastaları ve sağlıklı kontrollerdeki MEFV ekspresyon datamızla CpG adacığındaki metilasyon miktarını karşılaştırdığımızda, ekspresyon ve metilasyon arasında iki grupta da negatif bir korelasyon olduğu (cor=-0.29, P=0.041) ve bu korelasyonun hastalarda daha yüksek olduğu (cor=-0.36, P=0.035) gözlenmiştir. MEFV'nin alternatif formları daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. MEFV-fl tam boy proteini kodlarken, MEFV-d2 ekzon 2'yi içermeyen proteini; MEFV-8ext, MEFV-4a ve MEFV-2a intron içeren proteinleri kodlamaktadır. Gerçekleştirdiğimiz ekspresyon çalışmalarında farklı transkriptler incelenmemiş olduğundan, en sık gözlenen tam boy (MEFV-fl) ve ikinci ekzonu kırpılmış transkriptler (MEFV-d2) çalışma gruplarında tekrar araştırılmış ve MEFV-d2 transkriptinin hastalarda yüksek oranda eksprese olurken sağlıklı kontrollerde neredeyse hiç eksprese olmadığı gözlenmiştir (p=0.026). Artan metilasyon seviyesi ile doğru orantılı artış gösteren MEFV-d2 alternatif transkripti, MEFV CpG adacığı metilasyonu ile ekzon 2'nin alternatif kırpılması arasında bir ilişki olabileceğini düşündürmüştür. Bu bağlamda öncelikle alternatif kırpılmaya neden olabilecek varyasyonların varlığı araştırılmıştır. MEFV genindeki c.910G>A variantının (rs75977701) ekzon 2'nın kırpılmasıyla ilişkili olabileceği bildirilmiş; ancak çok nadir olan bu varyantın önceki AAA kohortumuzda olmaması, ayrıca bu ve benzeri varyantların Infevers veritabanı gibi hastalıkla ilişkilendirilmiş varyasyonların bildirildiği veritabanlarında bulunmaması, en azından Türk toplumundaki alternatif kırpılma ile ilişkili mekanizmalarda rol oynamadığını göstermiştir. MEFV genindeki metilasyonun ekzon 2'nin kırpılmasındaki olası rolünün araştırılması için öncelikle in vitro bir model oluşturulmuş, pSpliceExpress gen kaseti kullanılarak metilasyonun ekzon 2'nin tamamını içeren gen parçasının kırpılmasına sebep olduğu gösterilmiştir. Sonrasında farklı hücre modelleri oluşturularak hücrelerin kendi MEFV ekspresyonlarının hücre farklılaşması, metilasyon, dmetilasyon, aktivasyon ve histon deasetilasyonunun engellenmesi gibi durumlarda ne şekilde değiştiği incelenmiştir. Bu amaç doğrultusunda HL-60 promiyelosit hücreleri, dimetilsülfoksit (DMSO) ile nötrofil-benzeri hücrelere farklılaştırılmış, metanol ile global metilasyonu artırılmış, 5-aza-2′deoksisitidin (deazasitidin) ile global metilasyonu azaltılmış, forbol mistrat asetat (PMA) ve lipopolisakkarit (LPS) kullanılarak aktive edilmiş, son olarak trikostatin A (TSA) ile histon demetilasyonu engellenmiştir. Bu şekilde oluşturulan hücre modellerinde ikinci ekzonu içeren ve içermeyen transkriptlerin ekspresyonlarının kontrol hücrelere kıyasla nasıl değiştiği incelenmiş, ve alternatif kırpılmış transkriptin nötrofil-benzeri hücrelerinde 2 kat (p=0,0005), aktive edilen hücrelerde 2,5 kat (p=0,0034) ve metanol verilen hücrelerde de 2,5 kat (p< 0,0001) arttığı gözlenirken; deazasitidin verilen hücrelerde 1,7 kat (p=0,0126) azaldığı gözlenmiştir. TSA ile deasetilasyonu engellenen hücrelerdeki transkriptlerin seviyesinde anlamlı bir farkın gözlenmemesi, histon deasetilasyonunun, en azından oluşturulan hücre modelerinde, MEFV geninin ikinci ekzonunun alternatif kırpılması ile bir ilişkisi olmadığını göstermiştir. Yine aynı hücre modellerinde MEFV CpG adacığının ilk 61 CpG'yi kapsayan bölgesinin metilasyon seviyesi araştırılmış, belirli anlamlı artış/azalışlar görülmesine rağmen (Kruskal-Wallis test, p= 0,0184, Kruskal-Wallis statistic=9,567), deneyler arasında gözlenen yüksek varyasyondan dolayı bireysel örnekler arasında anlamlı bir fark görülmemiştir. Metanol ile global metilasyonu artırılan hücreler ve DMSO ile nötrofil benzeri hücrelere çevirilen hücreler arasında gözlemlenen ekspresyon ve metilasyon seviyeleri açısından benzerlik, metilasyonun nötrofile farklılaşma sürecinde bir rol oynayabilceğini düşündürmüştür. Bu hipotezi test etmek amacıyla metanol ile metilasyon seviyesi artırılan HL-60 hücrelerinin nötrofil-benzeri hücrelere dönüşüp dönüşmediği incelenmiş, ancak böyle bir değişimin olmadığı gözlenmiştir. Bu durum metilasyonun nötrofil değişim sürecinin sebebi değil, sonucu olabileceğini düşündürtmüştür. Son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalar, metilasyon ile alternatif kırpılma arasında bir ilişki olabileceğini göstermiştir. Transkripsiyon ile kırpılmanın hücrede aynı anda gerçekleşmesinin bu ilişkiyi mümkün kıldığı düşünülmektedir. Metilasyonun alternatif kırpılmayı iki şekilde etkileyebileceği önerilmektedir: Metilasyonun RNA Polimeraz II elongasyonunu etkilemesi veya kırpılma faktörlerinin çağırması yoluyla zayıf olan ekzon kırpılma bölgelerinin transkripsiyon mekanizmaları tarafından tanınması, ekzonların kırpılmadan eksprese olmasına olanak sağlayabilecektir. Bu iki mekanizmada rol oynayabilecek proteinlerden bir kısmı belirlenmiştir. MEFV'nin metilasonunun ekzon 2'nin alernatif kırpılmasındaki rolüne yardımcı olabilecek bir proteinin belirlenmesi amacıyla ekzon 2'nin tamamını içeren gen parçası metilli ve metilsiz olarak nükleer proteinlerle inkübe edilmiş, bu gen parçalarına bağlanan proteinler ayrıştırılmış ve SDS-PAGE ile incelenmiştir. Her ne kadar metilsiz gen parçasına bağlanıp metilli gen parçasına bağlanmayan proteinler tespit edilse de yapılan kütle spektrometri (MS) analizlerinde uygun bir skor elde edilememiştir. Düşük skorlarına rağmen iki aday çinko-parmak (zinc-finger) protein belirlenmiştir. Kromatin immünopresipitasyon analizleri yapılarak bu ve benzeri proteinler detaylı olarak araştırılabilir. Nörolojik hastalıklar ve çeşitli kanser türleri gibi birçok hastalığın protein lokalizasyonundaki değişikliklerden kaynaklandığı bilinmektedir. MEFV-fl transkriptinin kodladığı pyrin-fl ve MEFV-d2 transkriptinin kodladığı pyrin-d2 proteinlerinin birçok hücrede farklı hücresel bölgelerde bulunduğu bildirilmiştir: pyrin-fl genellikle sitoplazmada gözlenirken pyrin-d2'nin nukleus ve sitoplazma arasında yer değiştirebildiği gözlenmiştir. Bu kapsamda HL-60 hücreleri ile nötrofil-benzeri ve aktive hücrelerde rekombinant pyrin-fl ve pyrin-d2 proteinlerinin lokalizasyonları araştırılmıştır. Pyrin-fl tüm hücrelerde sitoplazmada izlenirken pyrin-d2'nin HL-60 hücrelerinde nukleusta, nörofil-benzeri ve aktive hücrelerde ise sitoplazmada olduğu gözlenmiştir. Pyrin proteininin inflamasyondaki rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bazı araştırmalar pyrin'in antienflamatuvar bir protein olduğunu öne sürerken, diğerleri enflamasyona sebep olabileceğini savunmaktadır. Yapılan çalışmalar Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) proteininin pyrin ile etkileşime girerek enflamasyonun oluşmasında rol oynayabileceğini öne sürmüştür. Aynı zamanda pyrin-d2 izoformunun enflamatuvar durumlarda ekspresyonu artan ASC ile etkileşerek nukleusa gitmek yerine sitoplazmada kaldığı gözlenmiştir. Enflamasyonu baskıladığı gösterilen 14.3.3 proteinlerinin pyrin-fl ile etkileşebildiği, ancak pyrin-d2'nin etkileşim için gerekli olan bölgeyi içermediğinden etkileşmediği gösterilmiştir. Burada sunulan tezde elde edilen sonuçlar ve literatürdeki veriler ışığında, AAA hastalığına sebep olabilecek yeni bir mekanizma önerilmektedir. Önerilen bu mekanizmada yüksek metilasyon seviyesi pyrin-d2 miktarını artırmakta; enflamatuvar koşullarda ekspresyonu artan ASC tarafından sitoplazmada tutulan pyrin-d2, 14.3.3 proteinleri ile etkileşemediğinden enflamasyon baskılanamamaktadır. Bu şekilde, gen varyasyonları dışında AAA hastalığına sebep olabilecek yeni bir model oluşturulmuştur.
Familial Mediterranean Fever (FMF) (OMIM no: 249100), is an inflammatory disease with recurrent fever attacks, prevalent in populations of Mediterranean descent. MEditerranean FeVer (MEFV) gene was identified as the gene of FMF by both International and French FMF Consortia. Up to 315 variations were defined to date, five of which (c.2080 A>G, p.Met694Val; c.2082 G>A, pMet694Ile; c.2177 T>C, p.Val726Ala; c.2040 G>C, p.Met680Ile and c.442 G>C, pGlu168Gln) were reported to be recessively inherited and cause FMF. On the other hand, 5 to 20% of patients, where FMF is not prevalent, were reported to carry no variations on their MEFV gene, suggesting that MEFV variations may not be the only cause of FMF. Recently, MHC Class I Polypeptide-Related Sequence A (MICA) gene was proposed as a modifier gene which may have an epistatic interaction with MEFV, however no significant results were obtained. Therefore, disruptions leading to changes in MEFV expression, independent of gene variations were thought to possibly play a role in FMF pathogenesis. MEFV is mainly expressed in white blood cells, as well as in synovial fibroblasts and dendritic cells. Studies have shown that MEFV expression in FMF patients were lower than healthy controls, being even lower during attack periods, and suggested that this decrease was due to inflammation. Previously, we observed expression levels in leukocytes isolated from 51 FMF patients and 11 healthy controls, with low MEFV expression in patients compared to healthy controls (p=0.031). On the other hand, another study group reported higher MEFV expression levels in FMF patients' peripheral blood mononuclear cells (PBMC) when compared with healthy controls' samples. Epigenetic mechanisms are one of many mechanisms that modulate gene expression. MEFV gene contains a 998 bp CpG island covering its whole second exon (NC_000016.10, 3254057 – 3255054). We compared our MEFV expression data with methylation levels of MEFV gene's CpG island in our study group, and observed a negative correlation between methylation and expression levels in both groups (cor=-0.29, P=0.041), of which the patient group's have been higher (cor=-0.36, P=0.035). Alternative spliced forms of MEFV mRNA were shown in previous studies. MEFV-fl is coding a full-length protein, whereas MEFV-d2 codes a protein lacking the second exon, with MEFV-8ext, MEFV-4a and MEFV-2a coding proteins containing intron fragments. As we did not assess different transcripts in our previous expression studies, we analyzed the expression levels of most common transcripts, MEFV-fl and MEFV-d2 in our study group. We found that MEFV-d2 was highly expressed in patients, while it is almost inexistent in the control group (p=0.026). Increase in MEFV-d2 expression proportional to increase in MEFV levels urged us to think that MEFV gene's CpG island methylation might play a role in the splicing of its second exon. Initially, we investigated possible MEFV variations that might lead to alternative splicing. Previously c.910G>A variant (rs75977701) was suggested to cause the splicing of MEFV gene's second exon. However, this rare variant was not detected in our previous FMF cohort, and was also absent in databases, like Infevers, where FMF related variations are submitted; eliminating it as a potential candidate. We first generated an in vitro model to test the possible role of methylation on MEFV gene in alternative splicing of its second exon, and showed that it leads to the splicing of the gene construct containing the whole second exon, using pSpliceExpress gene cassette. Then, we constructed different cell culture models to analyze the cells' endogenous MEFV expression under different conditions like cell differentiation, methylation, demethylation, activation and prevention of histone deacetylation. To this aim, HL-60 promyelocytes were subjected to dimethylsulphoxide (DMSO) for differentiation into neutrophil-like cells, methanol to increase global methylation, 5-aza-2′deoxycytidine (deazacytidine) to decrease global methylation, phorbol mystrate acetate (PMA) and lipopolysaccharide (LPS) for activation and trichostatin A (TSA) for prevention of histone deacetylation. We analyzed the expression levels of MEFV transcripts containing lacking the second exon in these cell models, compared to untreated controls, and observed that the transcript lacking the second exon was highly expressed in neutrophil-like cells (2 fold increase, p=0,0005), activated cells (2,5 fold increase, p=0,0034) and methylated cells (2,5 fold increase, p< 0,0001), and less expressed in demethylated cells (1,7 fold decrease, p=0,0126). We did not observe any significant expression variation in MEFV transcripts in cells treated with TSA, suggesting that histone acetylation do not have an effect on alternative splicing of MEFV gene's second exon, at least in our cell models. We also analyzed the methylation levels of first 61 CpGs of MEFV gene's CpG island in these cell culture models. Although one-way ANOVA test results demonstrated that we obtained significant results (Kruskal-Wallis test, p= 0,0184, Kruskal-Wallis statistic=9,567), individual t-tests performed between different models showed no significant differences possibly due to high variation among biological repeats. Similarity between methylation and expression levels observed in neutrophil-like and methylated cells suggested that methylation might play a role in the differentiation of the cells to neutrophil-like cells. We analyzed if methylated cells differentiate into neutrophil-like cells and found no sign of differentiation, suggesting that methylation might not be the cause but may be the consequence of differentiation. Recent studies have shown that methylation might play a role in alternative splicing through two mechanisms: by modulating the elongation rate of RNA Polymerase II, or by recruiting splicing factors to weak exons leading to their recognition by transcription machinery. Several proteins were defined to play a role in these two mechanisms. We incubated methylated and non-methylated gene fragments containing MEFV gene's second exon with nuclear proteins and separated proteins that bind the fragments. Differential proteins were assessed through SDS-PAGE analysis and sent to mass spectroscopy (MS) analysis. Although several proteins were found to bind non-methylated fragments and not to methylated ones, we could not obtain high scores in MS analyses. Two potential zinc-finger proteins were identified and should be further analyzed, along with other potential proteins using chromatin immunoprecipitation type analyses. Many diseases, like neurological disorders and cancer, have been linked to changes in protein subcellular localization. The protein coded by MEFV-fl transcript, pyrin-fl, was reported to be generally in the cytoplasm of various cells, and pyrin-d2 coded by MEFV-d2 transcript was found to shuttle between nucleus and cytoplasm. Therefore, we analyzed the localization of these two isoforms in neutrophil-like and activated cells and compared with untreated HL-60 cells. We observed pyrin-fl in the nucleus of all cells. On the other hand, pyrin-d2 was observed in the nucleus of HL-60 cells and in the cytoplasm of neutrophil-like and activated cells. There is still a debate on whether pyrin is an anti-inflammatory or a pro-inflammatory protein. Studies demonstrated that Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) protein interacts with pyrin to play a role in the development of inflammation. Furthermore, ASC can also interact with pyrin-d2, which prevents its translocation to the nucleus under inflammatory conditions. However, pyrin-d2 is unable to bind to 14.3.3 proteins that were shown to suppress inflammation, due to the lack of the residues needed for this interaction. We propose a new mechanism, which might lead to FMF formation in the light of the results presented hereby, combined with literature findings. In this mechanism, high methylation levels lead to an increase in the expression of pyrin-d2, which is kept in the cytoplasm by ASC, and cannot be blocked by 14.3.3 proteins, thus leading to inflammation. This model could present a new mechanism leading to FMF disease, independent of gene variations.