Tez No	İndirme	Tez Künye	Durumu
674779		Characterization of altered innate and adaptive immune responses of primary immune deficient patients / Birincil bağışıklık yetersizliği hastalarının doğal ve edinsel bağışıklık yanıtların karakterizasyonu Yazar:BİLGEHAN İBİBİK Danışman: PROF. DR. İHSAN GÜRSEL Yer Bilgisi: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics Dizin:	Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2021 121 s.
Bağışıklık sistemi düzensizlikleri birincil bağışıklık yetersizliklerine (PID'ler) yol açar. Bağışıklık yetersizlikleri doğal ve edinsel bağışıklık yetersizlikleri olarak iki gruba ayrılabilir. Doğal bağışıklık yetersizliklerinin nedenleri, otozomal resesif veya otozomal dominant mutasyonlardan kaynaklanan kalıtsal immün fonksiyon bozuklukları olabilir. Devam eden enfeksiyonlar, lifoproliferasyonlar, atopiler, maligniteler, otoimmünlikler ve granülomatöz süreçlerin kombinasyonları birincil immün yetersizlik bozukluklarında görülür. Tedaviler oluşturmak için, bağışıklık yetersizliklerinin karakterizasyonu ve bozulmuş mekanizmaların anlaşılması çok önemlidir. Bu çalışmada, farklı mutasyonların (RLTPR, RLTPR-TLR1, CTLA-4) doğal ve edinsel bağışıklık sistemleri üzerindeki etkileri araştırılmıştır. RLTPR (CARMIL2), T-hücresi aktivasyonu için CD28 ko-stimülasyonunu sağlayan bir sitozolik iskelet proteinidir. CD28 ko-stimülasyonunu sağlamasının yanı sıra, RLTPR, aktin polimerizasyonunu teşvik ederek hücre şekli kontrolü, fagositoz ve endositoz hareketlerini gerçekleştirir. Farklı çalışmalarda azalmış CD4 + T-hücreleri, bellek B-hücreleri ve B-hücresi reseptörü aracılı NFκB aktivasyonu, RLTPR eksikliği olan hastalarda gözlenmiştir. Ayrıca, T-hücrelerinin polaritesi ve göçü, RLTPR eksikliğinden etkilenmiştir. Burada, CMV enfeksiyonu olan ve olmayan RLTPR eksikliği olan hastanın immünolojik yanıtları incelenmiştir. Beklendiği gibi, hem enfeksiyonlu hem de enfeksiyonsuz hastanın Treg sayıları azalmıştır. Hastanın Treg hücre sayıları azalmış olmasına rağmen, devam eden savunma ve homeostaz nedeniyle enfeksiyonlu örnekte sitozolik nükleik asit ligandlarına bağlı IL-10 salımı artmıştır. CMV enfeksiyonu altında hasta, TLR'lerin ve sitozolik nükleaik asit sensörlerinin aktivasyonu üzerine artmış IL-1β ve TNF-α salımı göstermiştir. Bununla birlikte, herhangi bir viral enfeksiyon olmaksızın, hastada TLR7 ve TLR8 aracılı IL-1β ve TNF-α tepkileri bozulmuştur. Ayrıca, CMV enfeksiyonu altında, hastada TLR ve sitozolik nükleik asit sensörü aracılı antiviral IFN-α, IFN-γ ve IL-12 tepkileri artmıştır. Ancak enfeksiyondan sonra, hastanın endosomal TLR'lerden ve sitozoilk nükleik asit'lerden IFN-α ve IFN-γ yanıtlarını azaldığı görülmüştür. Viral enfeksiyon altında, doğal bağışıklık hücreleri ve bunların efektör sitokinleri tarafından devam eden savunmaya bağlı olarak daha yüksek yanıt görmesi bekleniyordu. Tıbbi tedavi ile enfeksiyon temizlendiğinde, RLTPR hastasında sadece endosomal TLR'lerin değil, sitozolik nükleik asit sensörlerinin de bozulduğu ve bu da hastayı viral enfeksiyonlara karşı savunmasız hale getirmiş olabileceği gözlenmiştir. Ardından, RLTPR ve TLR1 eksikliği olan hastanın bağışıklık tepkileri araştırıldı. Hastanın tam kanından azalan Treg hücre sayısı doğrulandı. Hastanın PBMC'leri TLR ve sitozolik nükleik asit ligandları ile uyarıldığında yüksek IL-1β salımı gözlendi. Özellikle TLR2-6 yanıtındaki yüksekliğin TLR1 eksikliğinin bir sonucu olabiliceği düşünülmüştür çünkü TLR1 eksikliğinde, TLR6'nın eksik olan immün yanıtı kompanse edilebilidiği bilinmektedir. Ayrıca, farklı PRR ligandlarına karşı verilen proinflamatuar sitokin tepkisi, devam eden enfeksiyonla gerekçelendirilebilir. Endosomal TLR ve sitozolik nükleik asit ligandları üzerinden IFN-α salımının arttığı gözlenmiştir. Hastanın IL-12 seviyeleri, devam eden bir enfeksiyonu düşündüren çeşitli yanıtlar göstermiştir. TLR1 eksikliğinden kaynaklanan TLR1 aracılı IL-12 yanıtı ise gözlenmemiştir. Ayrıca, hastada TLR2-6 aracılı IL-12 yanıtı daha yükselmiş ve bu da TLR1 eksikliğinin telafi edilmesine katkıda bulunduğunu düşündürmüştür. Hasta, Treg hücreleri azalmış olsa bile TLR ve sitozoilk nükleik asit ligandlarına yüksek IL-10 yanıtı vermiştir. T-hücrelerinin negatif düzenleyicisi olan CTLA-4, aktive edilmiş T-hücreleri ve Treg hücreleri üzerinde bulunur. CTLA-4, APC'ler üzerindeki CD80/86 ligandlarına bağlanarak CD28 ko-stimülasyonunu engeller. CD28 ko-stimülasyonu olmadan, T-hücresi aktive edilemez. Yetersiz CTLA-4 reseptörü olan hastaların, azalmış fonksiyona sahip artan sayıda Treg hücresine sahip olduğu bilinmektedir. Ayrıca farklı çalışmalarda hastaların azalmış hiperaktif T-hücreleri, artmış otoreaktif B-hücreleri ve dolaşımda azalmış B-hücreleri olduğu gösterilmiştir. Bu noktada, dört CTLA-4 hastasının bağışıklık tepkileri incelenmiştir. Hasta #1'de, yüksek CD4+/CD8+ oranı, yüksek LDG sayısı, ayrıca CD3+ hücrelerinde azalmış TCR ekspresyonu ve yükselmiş pAKT protein seviyeleri gözlenmiştir. Hasta #2, tam kanda artmış LDG sayımına, azalmış pDC ve Treg popülasyonuna sahipti. Hasta #2'ye benzer kan hücresi profilin ek olarak Hasta #3 artmış monosit yüzdesine ve daha düşük CD4+/CD8+ oranına sahipti, bu da devam eden bir enfeksiyonu gösterebilir. Hasta #4, azalmış pDC, Treg sayıları, CD8+ hücrelerinde, Treg hücrelerinde ve B-hücrelerinde artan PD-L1 seviyeleri, CD3+ T-hücrelerinde azalmış TCR ekspresyonu, artmış pAKT ve p4EBP1 protein seviyeleri göstermiştir ve bunların tümü CTLA-4 mutasyonunun otoimmün durumunu telafi etmeye katkıda bulunabilir.Tüm hastaların B-hücre yüzdeleri ve CTLA-4 ekspresyon seviyeleri değişmezken, mTOR, pmTOR, STAT3, pSTAT3, AKT, p4EBP1 ve HIf-1α protein seviyeleri bozulmuştu. Özet olarak, bulgularımız bu eksikliklerin düzensizliğinin karmaşıklığına işaret etmekte ve bu hastaların gözardı edilen bir immün fonksiyonel durumuna işaret etmektedir. Hastalıkları sadece edinsel bağışıklık sistemi ile ilişkili olarak algılanan bu bireylerin doğuştan gelen bağışıklık kolunun araştırılmasının, bu hastalara daha sağlam tedaviler sunmak için gerekli olduğunu öneriyoruz.
The immune system dysregulations led to primary immune deficiencies (PIDs). Immune deficiencies can be divided into two groups, primary and secondary immune deficiencies. The reasons for primary immune deficiencies could be inherited immune dysfunctions originated from autosomal recessive or autosomal dominant mutations. Combinations of ongoing infections, lymphoproliferation, atopies, malignancies, autoimmunities and granulomatous processes are seen in primary immune deficiency disorders. To establish distinctive therapies, characterization of immune deficiencies along with the understanding the course of impaired mechanisms are very critical to offer robust means of cure. In this study, the effects of different mutations (RLTPR, RLTPR-TLR1, and CTLA-4) on innate and adaptive immune systems were investigated. RLTPR (CARMIL2) is a cytosolic scaffold protein which facilitates CD28 co-stimulation for T-cell activation. RLTPR facilitates recruitment of CARMA1, a cytosolic adaptor, along with the BCL10 and MALT1 which form CBM complex to CD28 site to activate NF-κB signaling pathway. Besides facilitating CD28 co-stimulation, RLTPR takes place in cell shape control, phagocytosis and endocytosis movements by promoting actin polymerization. Reduced CD4+ T-cells, memory B-cells and antibody response along with the impaired B-cell receptor mediated NF-κB activation were mainly observed in RLTPR deficient patients. Moreover, polarity and migration of the T-cells were affected by RLTPR deficiency in patients. Herein, immunological phenotypes of RLTPR deficient patient with and without CMV infection were described. As expected, Treg counts of the patient were reduced as compared to healthy controls both with and without infection. Although Treg cell counts of patient were decreased, IL-10 secretion upon cytosolic nucleic acid ligands was increased in infection due to ongoing defense and homeostasis. Under CMV infection, patient showed elevated IL-1β and TNF-α responses upon activation of TLRs and cytosolic nucleic acid sensors. However, without any viral infections, TLR7 and TLR8 mediated IL-1β and TNF-α responses were impaired in patient. Moreover, under CMV infection, TLR and cytosolic nucleic acid sensors mediated antiviral IFN-α, IFN-γ and IL-12 responses were substantially increased compared to healthy subjects. Unexpectedly, when patient PBMCs were assessed following infection, we detect that IFN-α and IFN-γ levels of the patient in response to endosomal TLRs and cytosolic nucleic acids stimulations were reduced. Throughout the course of viral infection due to ongoing defense by innate immune cells, one would predict to detect higher type I and II IFN responses. When infection was cleared with medical treatment, it is observed that not only endosomal TLRs but also the cytosolic nucleic acid sensors were impaired in RLTPR patient which makes the patient vulnerable to viral infections. Thereafter, altered immune responses of RLTPR-TLR1 deficient patient was investigated. Decreased number of Treg cells from whole blood of the patient was confirmed. IL-1β response from PBMCs of patient was elevated by stimulation with the TLR and cytosolic nucleic acid ligands. Especially, TLR2-6 response was elevated which could be the result of TLR1 deficiency because immune response could be compensated when TLR1 is deficient but TLR6 is not. Also, remaining improved proinflammatory cytokine response to different PRR ligands could be reasoned by ongoing infection. IFN-α secretion was increased by endosomal TLR and cytosolic nucleic acid ligands while IL-12 secretion of patient showed ligand specific modulated responses which suggest an ongoing infection. As expected there was no detectable TLR1 mediated IL-12 response due to TLR1 deficiency. However, TLR2-6 mediated IL-12 secretion was elevated in patient compared to healthy subjects which could be regarded as a compensatory response against TLR1 deficiency. RLTPR-TLR1 deficient patient PBMCs elicited elevated IL-10 response to TLR and cytosolic nucleic acid ligand triggering even though Treg cells were reduced., implying that other suppressor cells could be involved in this response. CTLA-4, a negative regulator of T-cells, is expressed on activated T-cells and Treg cells. CTLA-4 binds to CD80/86 molecules on APCs which prevents CD28 co-stimulation. Without CD28 co-stimulation, the T-cell cannot be activated. Patients with insufficient CTLA-4 receptors could have an increased number of Treg cells with reduced function. CTLA-4 haploinsufficiency leads to hyperactive T-cells, enhanced autoreactive B-cells and reduced numbers of circulating B-cells. In this work, immune responses of four CTLA-4 patients were also studied. Patient #1 showed higher CD4+/CD8+ ratio, elevated LDG frequency, as well as reduced TCR expression on CD3+ cells and elevated pAKT protein levels. Patient #2 had increased LDG count, reduced pDC and Treg population in whole blood. Similar blood cell profile to Patient #2, Patient #3 additionally had increased monocyte percentage and lower CD4+/CD8+ ratio which could indicate an ongoing infection. Patient #4 showed decreased pDC, Treg counts, increased levels of PD-L1 on CD8+ cells, Treg cells and B-cells, reduced TCR expression on CD3+ T-cells, increased pAKT and p4EBP1 levels which all may contribute to compensate the autoimmune status of the CTLA-4 mutation. B-cell percentages and CTLA-4 expression levels of all patients were not altered while mTOR, pmTOR, STAT3, pSTAT3, AKT, p4EBP1 and HIf-1α expression levels were impaired in all patients. Collectively, our findings imply that the complexity of the dysregulation of these deficiencies, and point-out to an unappreciated immune functional status of these patients. We propose that investigation of the innate immune arm of these individuals which were perceived as solely related to and impacting only adaptive immune system is necessary to offer more robust therapies to these patients.