Tez No |
İndirme |
Tez Künye |
Durumu |
424388
|
|
Development of novel nanomaterials for non-viral gene delivery / Viral olmayan gen taşıma uygulamaları için yeni nanomalzemelerin geliştirilmesi
Yazar:NUR PINAR SANCAK
Danışman: DOÇ. DR. SEVİM IŞIK ; DOÇ. DR. MEHMET ŞENEL
Yer Bilgisi: Fatih Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Konu:Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin:
|
Onaylandı
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
76 s.
|
|
Gen tedavisi, kalıtsal yollarla veya sonradan dış etkenlerle normal işlevini yitiren
genler nedeniyle ortaya çıkan hastalıkların tedavisine yönelik dışarıdan normal çalışan
genin verilmesi ile yapılan tedavi şeklidir. Gen tedavilerinde viral veya non-viral gen
taşıma ajanları kullanılmaktadır. Gen taşıma ajanları ayrıca hastalık tedavisine yönelik
veya araştırma alanında rekombinant proteinlerin üretilmesinde kullanılmaktadır. Gen
taşıma ajanları özellikle kanser tedavisi, diyabet, çeşitli kalıtsal hastalıklar, hücresel ve
rejeneratif tıp alanlarında kullanılmaktadır.
Non-viral gen taşıma ajanları üzerine literatürde pek çok çalışma olmasına
karşın, boronik asit fonksiyonel ajanlar üzerine çok az çalışma vardır. Hali hazırda
yapılmış olan çalışmalarda boronik asit destekli gen taşıma ajanı sadece sentetik
polimerler olan polietilenimin (PEİ), poliamidoamin (PAMAM) ve amfifilik polieter
(Pluronic-PG) moleküllerinin boronik asit ile direkt modifikasyonundan elde edilmiştir.
Boronik asit destekli gen taşıma ajanı geliştirilebilecek pek çok alternatif malzeme
(doğal polimerler, farklı sentetik polimerler ve nanoparçacıklar) non-viral gen taşıma
ajanı olarak geliştirilmeyi beklemektedir.
Bu çalışmada, İnsan Embriyonik Böbrek Hücre (HEK 293) hattına boronat ester
oluşumuna dayalı yeni non-viral gen taşıma sistemlerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Bu çalışma kapsamında, nanoparçacıklara ön-modifikasyonlar yapıldı ve daha sonra
yeni modifikasyonlar yapılan non-viral gen taşıma ajanları gen taşıma etkinliklerinin
daha da arttırılması amacıyla boronik asit gruplarıyla fonksiyonel hale getirilerek yeni
non-viral gen taşıma sistemleri geliştirildi. Geliştirilen sistemler, G1'den G5'e artan
jenerasyonlardaki PAMAM ve boronik asitle modifiye edilen karbon nanotüpler, HEK
293 hücre hattına GFP plasmidinin aktarımında kullanıldı. Karbon nanotüplerin, HEK
hücrelerinin tutunma ve yaşama kabiliyetleri üzerindeki etkileri gerçek zamanlı hücre
analizi ve WST-1 hücre çoğalma analizi deneyleriyle ölçüldü. HEK hücrelerinin artan
jenerasyonlardaki karbon nanotüplerle 24 saat inkübe edilmesinin ardından elde edilen
sonuçlar, artan jenerasyonlardaki karbon nanotüplerin konsantrasonları arttıkça hücre
yaşamının azaldığını ve hücre çoğalmasının yavaşladığını gösterdi. GFP plasmidi ile
karbon nanotüplerin kompleks oluşumunu belirlemek için agaroz jel elektroforezi
yöntemi kullanıldı. Agaroz jel sonuçları, hem PAMAM hem de boronik asitle modifiye
edilen karbon nanotüplerin GFP plasmidi ile farklı kütle oranlarında farklı derecelerde
bağlanarak kompleks oluşturduklarını gösterdi. GFP transfekte olan hücreler, yaydıkları
floresan ışıma ile floresan mikroskobunda belirlendi ve sayıldı. In vitro gen taşıma
deneyleri, pEGFPN1'in HEK 293 hücrelerine aktarımında boronik asitle modifiye
edilen karbon nanotüplerin daha başarılı olduğunu gösterdi.
Bu çalışma göstermiştir ki, boronik asit modifiyeli karbon nanotüpler kullanılarak
gen aktarımı yapılabilir ve boronik asit-diol etkileşimi kullanılarak transfeksiyon verimi
artırılabilir. Ayrıca boronik asitle modifiye edilen karbon nanotüpler gen taşıma aracı
olarak kullanılabilir, bununla birlikte in vivo gen aktarım çalışmalarının yapılması
gereklidir.
|
|
Gene therapy is a medical procedure used to treat diseases caused by
nonfunctional genes and it involves replacing those nonfunctional genes with healthy
ones that supplied from outside. In gene therapy, both viral and non-viral gene delivery
agents are used. The gene delivery agents are also used to produce recombinant proteins
for various disease treatments and related researches. In particular, the gene delivery
agents are used in the treatments of cancer, diabetes, some genetic diseases along with
cellular and regenerative medicine fields.
Although there is a good number of works about non-viral gene delivery agents
in the literature, there are quite few researches on boronic acid containing gene delivery
agents. In current studies, boronic acid containing gene delivery agents are obtained
only by direct modification of synthetic polymers such as polyethylenimine(PEI),
Poly(amidoamine) (PAMAM) and amphiphilic polyether (Pluronic-PG) with boronic
acid. Still, there are many alternative materials, such as natural polymers, different
synthetic polymers and nanoparticles, suitable for developing boronic acid-assisted gene
delivery agents.
In this study, it is aimed to develop novel non-viral delivery systems based on
boronate ester formation in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 Cell line. Within the
scope of this study, carbon nanotubes (CNTs) were pre-modified and then, new non-
viral gene delivery systems were developed by functionalizing with boronic acid groups
in order to increase their gene delivery efficiency. Also, this study was focused on the
pEGFPN1 delivery into human embryonic kidney 293 cells (HEK) by using
polyamidoamine(PAMAM) dendrimer modified CNTs and boronic acid (BA) modified
CNTs at increasing generations (from G1 to G5). The effects of CNTs on cell
attachment and viability of human embryonic kidney 293 cell line in vitro were measure
by real time cell analysis (RTCA) and WST-1 cell proliferation assay. Results showed
that after incubation with two types of CNTs over 24 h, the cellular viability and the
metabolic activity of HEK 293 cells decrease at increasing concentrations of CNTs. To
detect the pEGFPN1 and CNTs complex formation, agarose gel electrophoresis was
used. Agarose gel electrophoresis results demonstrated that each type of CNTs is able to
condense DNA to varying degrees at different mass ratios. Fluorescence emitting GFP-
transfected cells were observed and counted under a fluorescent microscope. In vitro
transfection results showed that BA-MWCNTs were more effective than PAMAM-
MWCNTs for in vitro pEGFPN1 delivery on HEK 293 cells.
In conclusion, this study shows that the gene delivery might be achieved using
boronic acid modified carbon nanotubes and also transfection efficiency might be
increased by making use of boronic acid-diol interaction. Additionally, Boronic acid
modified multiwalled CNTs might be used as gene delivery agents; therefore further in
vivo studies are required. |